一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域，涉及一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法。
【背景技术】
[0002]随着人民生活的提高，高血糖人群的日益扩大，由高血糖引起的糖尿病，血液循环系统疾病对人类健康危害越来越大。近年来的研究数据显示，肠道菌群与2型糖尿病密切相关。双歧杆菌是人体肠道菌群中的优势菌属，是人类健康的重要标志之一。双歧杆菌数量的减少可导致整个肠道菌群失调和肠道微生态失衡，从而导致众多代谢性疾病的发生。双歧杆菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖诱发的胰岛素分泌功能，降低高脂饮食诱导的糖尿病小鼠内毒素血症和血浆脂肪组织的促炎症因子水平，从而改善糖尿病代谢紊乱的状态。寡糖的岩藻糖基化是通过岩藻糖基转移酶将岩藻糖基转移到寡糖上完成的。岩藻糖基化寡糖在真核生物的多种生理和病理过程中发挥重要作用。浒苔隶属绿藻门石莼目石莼科浒苔属植物，具有取材方便、价格低廉的优点，是开发海洋药物的极好资源。目前，功能性浒苔寡糖研究相关报道极少，尚未见糖基化浒苔寡糖降血糖和促进肠道益生菌增殖功能研究的相关报道或专利。本发明制备的糖基化浒苔寡糖对P葡萄糖苷酶具有强抑制活性，能显著促进肠道益生菌增殖，在制备治疗和预防糖尿病肠道疾病药物及保健品上的应用具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法。制备工艺路线简单有效，增强了功能性寡糖的活性，是一种绿色高效制备糖基化功能性寡糖的有效方法，极大提升了绿藻浒苔资源的经济附加值。制备的糖基化浒苔寡糖对葡萄糖苷酶具有强抑制活性，能显著促进肠道益生菌增殖，并且具有改善肠道菌群的功效，对肠道益生菌双歧杆菌增殖有明显促进作用。本发明糖基化浒苔寡糖可应用于降糖益生菌制剂药物或保健品的制备，所要解决的技术问题是提供一种疗效好且利用度高的防治糖尿病改善肠道菌群的糖基化寡糖。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
(1)取干燥、超微粉碎、过80-100目筛的浒苔粉末，按重量体积比(g/mL)1:20-30加入质量浓度为60%-80%的乙醇溶液，60-90 0C下200-400W超声提取1-1.5小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的3-8%，真空冷冻干燥后粉碎，过50-80目筛；
(2)向步骤(I)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为(g/mL)l:10-20，进行揽摔复溶，用Sevag法、二氣二氯乙烧法、二氯乙酸法中一种或几种除蛋白3_5次；
(3)将步骤(2)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比(g/mL)l:30-50去除色素，于摇床中60-80 !?/111；[11振荡1-211，4000-6000印1]1离心15-20 min，收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3-8%，然后按体积比1:3-4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4-10°C条件下静置24 h，6000-8000rpm离心15-20min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过50-80目筛；
(5)将步骤(4)中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量与水体积比(g/mL)为1:20-50，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37-40°C及转速为60-80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
(6)步骤(5)得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比(mg/mL)l:1-2溶解于蒸馏水中，将商品化岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量与体积比(mg/mL) 1:3-5，反应体系中消1笞寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比(mM) 1:1.0-1.5 ,MgCl2终浓度为 15-20 mM，pH6.5-8.0，置于35-40°C温度，80-100 r/min摇床条件下反应24 -36 ho
[0005](7)将步骤(6)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，8000_10000 r/min离心15-20min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品。
[0006](8)将步骤(7)所得粗品溶解后过B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
[0007]本发明的优点在于:本发明利用岩藻糖基转移酶生物反应制备出具有防治2型糖尿病改善肠道菌群的糖基化浒苔寡糖，尚未见到岩藻糖基化浒苔寡糖促进肠道益生菌增殖的报道。本发明简单易操作，提高了功能性寡糖的原有活性，减少了岩藻糖基化寡糖制备的生产成本。同时，本发明能有效合理的综合利用浒苔资源，提高其商品价值与经济附加值。
【附图说明】
[0008]图1浒苔寡糖对a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。
[0009]图2糖基化寡糖对婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis增殖影响。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
(I)取干燥、超微粉碎、过80目筛的浒苔粉末，按重量体积比(g/mL)1: 20加入质量浓度为60%的乙醇溶液，60°C下200W超声提取I小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的3%，真空冷冻干燥后粉碎，过50目筛；
(2 )向步骤(I)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为(g/mL ) 1:1O，进行搅拌复溶，用三氟三氯乙烷法除蛋白3次；
(3)将步骤(2)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比(g/mL)l: 30去除色素，速度为60 r/min振荡I 11，4000印1]1离心15 min，收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3%，然后按体积比1:3加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4°C条件下静置24 h，6000rpm离心15min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过50目筛；
(5)将步骤(4)中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量与水体积比(g/mL)为1:20，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37°(:及转速为60 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
(6)步骤(5)得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比(mg/mL)l:1溶解于蒸馏水中，将商品化岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量与体积比(mg/mL)l:3，反应体系中消1笞寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比(mM)l: 1.0，MgCl2终浓度为15禮，？!16.5，置于35°(:温度，80 r/min摇床条件下反应24 h。
[0011](7)将步骤(6)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，10000r/min离心20min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品。
[0012](8)将步骤(7)所得粗品溶解后过B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，
5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
[0013]
实施例2
(1)取干燥、超微粉碎、过100目筛的浒苔粉末，按重量体积比(g/mL)1:30加入质量浓度为80%的乙醇溶液，900C下400W超声提取1.5小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行3次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的8%，真空冷冻干燥后粉碎，过80目筛；
(2)向步骤(I)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为(g/mL)1:20，进行搅拌复溶，用Sevag法除蛋白5次；
(3)将步骤(2)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比(g/mL)l: 50去除色素，于摇床中80r/min振荡2 11，5000印1]1离心17 min，收集上清液；
(4)将步骤