弯曲杆菌疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及弯曲杆菌疫苗。更确切地说，本发明涉及弯曲杆菌疫苗，其包含表达 来源于N-糖基化路径的空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni)七糖聚糖的大肠杆菌 (Escherichia coli)细胞。
【背景技术】
[0002] 在北美和许多工业化国家中，革兰氏阴性细菌弯曲杆菌是人类胃肠炎的最常见细 菌性病因。弯曲杆菌也是包括家禽在内的家畜（其被认为是人类弯曲杆菌症的主要来源） 中的显著食源性病原体。因此，家禽中弯曲杆菌的农场上控制将降低人类暴露于此病原体 的风险且对食品安全和公共健康具有显著影响。
[0003] 弯曲杆菌是许多发展中国家特有的，主要由于卫生条件较差以及人类与作为病 原体蓄池的动物的密切接触。卡塔日娜（Katarzyna)等人疫苗专家评论（Expert Rev. Vaccines) 8:625-645, 2009)的报导提出，在美国，弯曲杆菌感染是每年150万（世界卫生组 织（World Health Organization)数据）到 240 万（美国疾病控制中心（U.S. Centers for Disease Control)数据）疾病病例的病因。另外，根据世界卫生组织，每年约1 %的西欧人 群被弯曲杆菌属感染。人类感染主要由两个种引起：大肠弯曲杆菌（C. coli)和空肠弯曲杆 菌，其引起超过95%的弯曲杆菌症病例。弯曲杆菌感染的临床表现可在无症状病例到重度 胃肠炎（有时伴随着持久的粘液、血性或水样腹泻）范围内变化。
[0004] 林军（Jun Lin) "家禽中弯曲杆菌控制的新颖方法（Novel Approaches for Campylobacter Control in Poultry) "（食源性病原体和疾病（F00DB0RNE PATHOGENS AND DISEASE)，第6卷，第7期，第755-765页，2009)的公开案（其以引用的方式并入本文 中）论述减少家禽中弯曲杆菌感染的各种策略。林提出在农场层面控制家禽中弯曲杆菌的 三种一般策略：（1)减少环境暴露（生物安全措施），（2)提高家禽的宿主抗性以减少弯曲 杆菌在消化道中的运送（例如竞争性排斥、疫苗接种和宿主遗传选择），和（3)使用抗微生 物替代方案以降低且甚至消除来自定殖鸡的弯曲杆菌（例如噬菌体疗法和细菌素治疗）。 林进一步陈述了，除了生物安全措施，另一干预方法是商业上不可获得的且仍处于开发中。
[0005] 从家畜消除这些病原体可用作降低人类感染发生率以及防止在农场动物中扩散 的手段。农场上的疫苗接种还可降低来自食用或处理动物产品的人类污染以及来自家畜粪 肥的通过粪便排出细菌的污染的风险。用抗生素治疗弯曲杆菌症也变得越来越具挑战性， 因为弯曲杆菌对先前有效抗生素的抗生素抗性变得更常见。
[0006] 糖基化一度被明确认为是一种真核现象，但后来展示为在古细菌和细菌两个域 中广泛分布。细菌〇-和N-键与在真核糖蛋白中观察到的那些相比在较宽范围的糖的 情况下形成。细菌中蛋白质的一般糖基化路径首先展现在空肠弯曲杆菌中。（希曼斯基 (Szymanski)等人分子微生物学（Molecular Microbiology) 32:1022-1030, 1999)。空肠弯 曲杆菌的糖基化机制已经表征且已甚至成功地转移到大肠杆菌中（瓦克（Wacker)等人科 学（Science)，298:1790-1793, 2002)且展现蛋白质的活性N-糖基化（杨（Young)等人生物 化学杂志（J Biol Chem), 277:42530-42539, 2002 ;瓦克等人科学，298:1790-1793, 2002)。 空肠弯曲杆菌的基因座（称为pgl (用于蛋白质糖基化））参与多种蛋白质的糖基化。其突 变沉默在许多生物学表现型之中引起多种蛋白质的免疫原性丢失。
[0007] 美国专利申请公开案2006/0165728A1 (现在的美国专利第7, 598, 354号，其以引 用的方式并入本文中）鉴别了一种特异性且高度免疫原性的七糖，其存在于空肠弯曲杆菌 的多种周质和表面暴露糖蛋白中。此七糖是至少数种弯曲杆菌种和作为人类和兽医学病原 体重要的许多菌株所共有的（诺萨夫（Nothaft)等人分子和细胞蛋白质组学（Mol. Cell. Proteomics)ll:1203-1219,2012)。七糖具有下式（I) :GalNAc-al，4-GalNAc-al，4-[Gl c-0-l，3]GalNAc-a l，4-GalNAc-a l，4-GalNAc-a 1,3-diNAcBac，其中 diNAcBac(也称为 二-N-乙酰基杆菌胺）是2, 4-二乙酰胺基-2, 4, 6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖，GalNAc是N-乙 酰基-半乳糖胺且Glc是葡萄糖。此聚糖部分是多种糖蛋白的组分。在空肠弯曲杆菌中， N-聚糖对于空肠弯曲杆菌与宿主细胞的相互作用很重要。糖基化机制中的突变引起小鼠 和鸡中的肠道的定殖减少。在空肠弯曲杆菌中，N-聚糖对于以下各项很重要：人类上皮细 胞的附着和侵袭（希曼斯基等人传染与免疫（Infect Immun)70:2242-2244, 2002)、小鼠和 鸡的肠道定殖（凯莉（Kelly)等人细菌学杂志（J Bacteriol) 188:2427-2434, 2006 ;希曼 斯基等人传染与免疫70:2242-2244, 2002;亨德里克松（Hendrixson)和迪里塔（DiRita)， 分子微生物学（Mol Microbiol) 52:471-484, 2004;卡里雷切夫（Karlyshev)等人微生物学 (Microbiology) 150:1957-1964, 2004)、在IV型分泌系统情况下菌株中的天然感受态（拉 森（Larsen)等人细菌学杂志186:6508-6514,2004)以及结合于人类巨噬细胞C型凝集素 MGL(凡佐尔格（van Sorge)等人，细胞微生物学（Cell Microbiol) 11:1768-1781, 2009)。 此外，弯曲杆菌表面N-聚糖展示出起到对抗鸡消化道蛋白酶的保护性作用，使得细菌适合 度增加（阿伦卡（Alemka)等人传染与免疫81:1674-82, 2013)。
[0008] 美国专利申请公开案2012/0100177描述一种肠道沙门氏菌菌株，其包含空肠弯 曲杆菌的至少一个pgl操纵子或其功能衍生物且在其细胞表面上呈现空肠弯曲杆菌的至 少一种N-聚糖或其聚糖衍生物。此重组肠道沙门氏菌被假设适用于对抗弯曲杆菌感染的 疫苗，尤其在家畜（如家禽）中。然而，令人遗憾的是，后续公开案展示出，虽然在其表面 上表达来自弯曲杆菌的N-聚糖的重组肠道沙门氏菌能够定殖鸡而不引起疾病，但在经疫 苗接种的鸡中无可检测的对抗弯曲杆菌N-聚糖的体液免疫反应（托曼（Thommen) "呈现 鼠伤寒沙门氏菌的弯曲杆菌N-聚糖：一种用于肉鸡的新疫苗？（Campylobacter N-glycan presenting Salmonella Typhimurium: a new vaccine for broiler chickens ?)'，苏黎 士开放储存库和档案（Zurich Open Repository and Archive),苏黎士大学（University of Zurich),论文，兽医学院（Vetsuisse Faculty), 2011)。此外，在用空肠弯曲杆菌攻击 感染后，经疫苗接种的鸡中的空肠弯曲杆菌定殖并未减少。
[0009] 仍然需要一种预防和/或治疗人类和动物（具体地说家畜，更具体地说家禽）中 弯曲杆菌感染的有效疫苗。
[0010] 出于申请人认为已知信息与本发明可能相关的目的，提供此背景信息。未必打算 承认，或不应理解为前述信息中的任一个构成针对本发明的现有技术。
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的是提供一种对抗弯曲杆菌的疫苗。根据一个方面，提供一种疫 苗组合物，其包含经工程化以在其细胞表面上表达弯曲杆菌的至少一种N-聚糖或其聚糖 衍生物的细菌；和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、佐剂或载剂中的一个或多个。在某些 实施例中，弯曲杆菌种是空肠弯曲杆菌。细菌可以是大肠杆菌或沙门氏菌，且经工程化细菌 在其表面上表达空肠弯曲杆菌七糖。
[0012] 在某些实施例中，疫苗组合物包含活的、经工程化大肠杆菌或活的、减毒的、灭活 的或杀灭的经工程化大肠杆菌细胞。组合物可包含经工程化细菌于适合的缓冲稀释液（如 磷酸盐缓冲盐水）中的悬浮液，且可经调配以例如用于经口投与、卵内投与、肠胃外投与 (例如通过注射或输注投与）或喷雾。疫苗组合物还可经调配以用于添加到家畜饲料、饲料 添加剂或水中以及用于投与家禽（如鸡）。
[0013] 根据另一方面，提供一种疫苗接种动物对抗弯曲杆菌的方法，所述方法包含投与 动物如本文所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含经工程化以在其细胞表面上表达弯曲 杆菌（如空肠弯曲杆菌）的至少一种N-聚糖或其聚糖衍生物的细菌；和生理学上可接受的 稀释剂、赋形剂、佐剂或载剂中的一个或多个。
[0014] 已知沙门氏菌上N-聚糖的表达并不诱发保护性免疫反应。出人意料的是，本发明 人发现大肠杆菌（其是一种与沙门氏菌极其类似的细菌且预期将获得类似结果）当表达 N-聚糖时确实诱发鸡中的保护性免疫反应。
【附图说明】
[0015] 为了更好地理解本发明以及本发明的其他方面和进一步特征，提及与随附图式结 合使用的以下说明，在所述随附图式中：
[0016] 图1展示来自大肠杆菌聚合酶突变体的大肠杆菌蛋白酶K处理的细胞裂解物。
[0017] 图2展示脂质A-N-聚糖的结构和经纯化脂质A-空肠弯曲杆菌N-聚糖组分的NMR 实验
[0018] 图3展示使用大肠杆菌聚合酶突变