专利名称：一种弯曲单孢菌海藻糖合成酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及一种弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因及其应用。
背景技术：
海藻糖(Trehalose)是由两分子葡萄糖以α，α-1，1_糖苷键相连而成的非还原性二糖，1832年由Wiggers首次将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化，如脱水、高渗变化后造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，因此被誉为“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用，随着人类社会的发展和进步，希望能将海藻糖应用于日常生活所常用各类食品的鲜味保持与质地改善，更好提高人们的生活和健康水平，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。海藻酮糖(Trehalulose)和异麦芽酮糖(lsomaltulose)都是蔗糖(sucrose)的异构体，蔗糖是以α，α-1，2_糖苷键结合而成的一种二糖，海藻酮糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α，α-1，1_糖苷键结合而成的一种二糖，异麦芽酮糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α，α-1，6_糖苷键结合而成的一种二糖。海藻酮糖和异麦芽酮糖都是蔗糖的同分异构体，但是它们的化学性质和物理性质有很大区别，异麦芽酮糖甜度为蔗糖的 42%，几乎不吸水，一般认为没有吸水性，即使添加1. 5 15%的柠檬酸，其吸湿性也不会增加，因此这种不吸水和不发粘的特性非常适合用以生产需要干燥保存的食品和药剂。与异麦芽酮糖不同的是海藻酮糖则具有很高的溶解度和吸水性，甜度是蔗糖的70%，在室温的条件下其溶解度达到90%以上，其溶液几乎不能被结晶，在容易析出结晶的溶液中只要添加少量的海藻酮糖就可以有效的减少溶液中的结晶析出。自然界中的海藻酮糖在蜂蜜中的含量最高，所以纯的蜂蜜浓度高也不容易结晶。这种高吸水性和不易结晶的特性非常适合用以生产高级液体饮料、液体状药物制剂以及化妆品等。但是自然界中的海藻酮糖和海藻糖同样都是含量很低的糖，即使在含量最高的蜂蜜含量也在以下，而且由于海藻酮糖的高吸水性和不易结晶的特性，使得其分离纯化十分困难，所以需要找到可以生产更高纯度海藻酮糖糖浆的制备方法。目前已经在多种微生物中分离到多种不同类型的海藻糖合成酶及其相关的基因，目前发现的海藻糖合成相关酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途径可以分为三种途径，第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成途径，主要由径6-磷酸海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase)禾口 6_ 憐酸海藻糖酉旨 (Trehalose-6-phosphate phosphatase)组成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖合成 6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖；第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶合成途径，主要是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen， MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase)组成，先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物，通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的α，α_1，4糖苷键转变成α， α-1，1糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下一个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖；第三种途径是海藻糖合成酶途径，与其它海藻糖合成途径不同是这种途径只有一种酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase, Tre S)组成，它作用的底物是麦芽糖(Maltose)，通过催化麦芽糖分子内转糖基，将α， α-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为α，α_1，1糖苷键，麦芽糖转变成海藻糖。第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖， 在生产成本很难产生竞争优势，第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有很强的竞争优势，第三种途径和第二种途径相比，第三种途径只需要一种酶，在利用基因工程菌生产重组酶，由于不用生产两种酶，不需要考虑两种的反应条件是否一致，因此在生产过程中设备的占用率会更低，生产工艺会更简单，因而具有更强的竞争优势。蔗糖的纯度可以达到99%以上，是最适合制备海藻酮糖的底物，产物可以直接应用于食品和医药。目前文献公开报道能转化蔗糖生成海藻酮糖的酶主要有三种类型，一种是蔗糖异构酶也称α-葡糖基转移酶，对蔗糖的转化率可以达到90%，但它转化蔗糖的产物是海藻酮糖和异麦芽酮糖等比例的混合糖浆；第二种是海藻糖酮糖合成酶，它能转化蔗糖生成海藻酮糖，蔗糖转化率可以达70%以上，但一般反应速度较慢，但这类酶不能以麦芽糖为底物生成海藻糖；第三种能转化蔗糖生成海藻酮糖就是海藻糖合成酶，有研究发现某些海藻糖合成酶能以蔗糖为底物生成海藻酮糖，但是目前报道能转化蔗糖生成海藻酮的海藻糖合成酶以蔗糖为底物时糖蔗糖的转化率都较低，一般都低于5%。目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因的相关酶用于制备海藻糖，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶学特性与酶活力不同，而且大部分还没有得到工业规模化的应用。关于海藻酮糖合成酶基因在国内还没有见到相关报道，关于海藻酮糖合成酶的应用和海藻酮糖生产的专利也还没有相关的报道。
发明内容
本发明目的是提供一种弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因及其应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的本发明人利用生物信息手段对GenBank中庞大的DNA序列和氨基酸序列资源进行同源性检索分析，对已经完成序列分析的上千种微生物的DNA序列进行大量核酸序列进行分析和对比，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是某功能蛋白质”的极为有用基因，推测该序列的功能，找到候选基因序列，然后进行功能鉴定实验，最终确定基因的功能和性质，其中包括至今为止人们并未发现的海藻糖合成酶基因(treS)，并用这种合成酶基因经过克隆和进行重组表达，再利用重组表达的海藻糖合成酶用于转化麦芽糖生产海藻糖。本发明人在研究海藻糖合成酶基因的过程中，对一种中文名称为弯曲高温单孢菌，拉丁名为Thermomonospora curvata的基因组序列进行同源检索分析，发现这一段尚未有文献报道其功能的DNA序列，这段DNA序列在Genbank中被注释为“假定的海藻糖合成酶基因，，(putative trehalose synthase)。弯曲高温单抱菌(Thermomonospora curvata) 是一种嗜热菌，通常可以在高温堆肥中能分离到，具有分解纤维素的能力，生长温度范围广泛，可以在的温度下生长，最适生长温度为50°C，这种生长温度范围广泛特性可能与海藻糖合成酶基因的有关。经过分析这段DNA与已经有文献报道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有较高的同源性，同源性达到70%以上，而其编码的假定的蛋白质的氨基酸序列与已发表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸也有较高同源性，氨基酸同源性达到80%以上，所以很难通过氨基酸序列确定其为何种酶，必须要经过具体实验来鉴定这段基因的功能，确认其是什么酶，目前也还没有该基因功能的实验鉴定相关报道。本发明所述的海藻糖合成酶基因克隆自弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)，该菌种可以从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量约为69. 35kD2、等电点约为PI = 4. 73、酶的最适反应温度为；35 45°C4、酶的反应的pH在6. 0 7. 5，优选pH为6. 5 7. 05、当Ni2+，Fe3+, Mn2+，Mg2+，Ca2+等金属离子的浓度在5m mol/L时，该酶的活力不受影响，但狗2+，&12+，012+金属离子在5m mol/L的浓度时会对该酶的活力产生一定的抑制，只剩有85%左右的活力。6、酶达到一定浓度后，反应产物中海藻糖含量达到最高，继续添加过量的酶会降低海藻糖的含量，而副产物葡萄糖的含量会升高。7、该海藻糖合成酶能以蔗糖为底物生成海藻糖酮糖，反应速度较以麦芽糖为底物慢，但反应时间超过M个小时后，反应产物中海藻酮糖的含量达到83%以上。本发明人所采用的实验方法，包括众所周知的聚合酶链式反应(PCR)技术；DNA的提取、酶切、连接等DNA分子操作技术，把这一段标记为假定的海藻糖合成酶基因的DNA序列连接到表达载体上，如PSE380等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，经过细胞破碎，例如利用溶菌酶、超声波或机械碾磨法等破碎细胞后，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定其功能和酶学特性，证实了这一 DNA片段编码的是一种特性特征与前人发现的完全不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最适反应温度和最适PH不同，反应条件不同，酶对底物得特异性以及对麦芽糖转化为海藻糖比例的差异等特性，因此判定是一种新的发现。本发明所述的海藻糖合成酶的基因克隆自弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)，该酶在天然的弯曲高温单孢菌中是一种胞内酶，需要用细胞破碎的方法才能检查到；而且在天然菌中该酶的含量也非常低，需要将培养液浓缩1000倍浓缩以上才能检验到海藻糖合成酶的活力，无法满足工业化生产的要求。应用基因工程菌来表达本发明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高数千倍，可以用于海藻糖和海藻酮糖的生产。编码本发明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段未确定功能的DNA片段，长度为1803个碱基对，编码601个氨基酸，GC含量为68%。本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势1、同样具有转化麦芽糖生成海藻糖的功能，但属于分子量较小的一类海藻糖合成酶，分子量与日本林原研究所专利报道的来自Pimerlobacter sp. R48的海藻糖合成酶，与中国专利专利号为ZL200410013007. 3的报道的Thermobifida fusca海藻糖合成酶相差不大，但是比日本林原研究所报道的来自水栖嗜热菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶少 363个氨基酸，比中国专利号为ZL200410073883. 5报道的腾冲嗜热厌氧菌的海藻糖合成酶少了 179个氨基酸。小分子量的蛋白酶更加容易通过基因重组与表达技术来进行工业化的生产，因而更有市场竞争力。2、酶的最适反应温度为35 45°C，是适中的最适反应温度，与中国专利专利号为 ZL00710100350.5的报道的一种海藻糖合成酶及其应用的最适反应温度是20°C，与中国专利专利号为ZL200410013007. 3的报道的Hiermobifida fusca海藻糖合成酶的最适反应温度是25-30°C，与中国专利号为ZL200410073883. 5报道的一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用的最适合反应温度60-70°C相比。在底物转化率和反应速度基本相同的条件下，在35 45°C较温和的反应条件下，在生产上不需要过度升温或者降温来保持生产设备的温度，在节约能源上有优势。3、具有对两种底物高效的转化能力，不仅能转化麦芽糖生成70%以上的海藻糖， 还能以蔗糖为底物生成80%以上海藻酮糖，这样就可以同时以麦芽糖和蔗糖为反应底物， 反应产物中就会得到以海藻糖和海藻糖酮糖为主要成分的并同时还含有麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的混合糖浆，这种糖浆可以再进一步利用转糖苷酶进行反应，就可生产得到含有麦芽糖三糖、异麦芽三糖、潘糖、海藻糖葡萄糖三糖、海藻糖果糖三糖、海藻酮糖葡萄糖三糖和海藻酮糖果糖三糖等多种三糖混合物糖浆。混合寡糖比单一的寡糖具有更强的保健作用，这种多种三糖的混合糖浆也称为人造蜂蜜，如果用两种酶来制备混合糖浆就要考虑两种酶不同的反应条件。
图1为海藻糖合成酶以麦芽糖为底物的反应产物分析。图2为海藻糖合成酶以蔗糖为底物的反应产物分析。图3为海藻糖合成酶的最适反应pH值得分析。图4为海藻糖合成酶的最适反应温度值的测定。图5为金属离子对海藻糖合成酶酶活影响的测定。图6为海藻糖合成酶转化麦芽糖不同反应时间的反应产物中各种糖含量变化分析。
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图7为添加不同酶量对海藻糖合成酶转化麦芽糖的反应产物中各糖含量变化分析。图8为海藻糖合成酶转化蔗糖反应不同时间的产物中各糖含量变化分析。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容，有些对本领域专业人员来说显而易见的扩展内容虽然并未在本发明说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。1、弯曲高温单孢菌的培养弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata，菌株编号为41067)中国农业微生物菌种保藏管理中心购买，接种于以下培养基(克/升)葡萄糖4. O克，酵母提取物10克， 麦芽提取物10克L，用KOH调pH至7. 2，然后在50 55°C恒温摇床上振荡48小时，用于总 DNA的提取。2、弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因的克隆、表达及粗酶的制备根据Genbank中公布的Hiermomonospora curvata基因序列中注释为可能为海藻糖合成酶基因的序列，命名为Tct，设计相应引物扩增该基因并连接到表达载体上然后导入大肠杆菌进行表达，设计引物如下上游引物(Senseprimer) 5' -CTGCC ATGGAGATGACCGGGGACCCC‘下游引物(AntisensePrimer) 5' -TCA AAGCTT TCACTTCGCCGTCTGCCG-3‘上下游引物的5 ‘端分别设计了的Nco 1和Hind III酶切位点，用于将PCR产物连接到表达载体PSE380上，用设计好的引物扩增可能为海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Tct，扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用Nco 1和Hind III进行双酶切，与同样利用Nco 1和Hind III进行双酶切的表达载体PSE380进行连接，然后经过筛选验证得到Tct基因的表达重组质粒pSE380-Tct，然后用于表达制备海藻糖合成酶。把重组的表达质粒pSE380_Tct转化到大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞中，挑取单菌落转化子于LB液体培养基中，在37°C摇床中培养，当0D600达到0. 8左右时，加入IPTG 使其终浓度达到lmmol/L，继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于转化麦芽糖的试验。3、弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶转化麦芽糖产物的分析利用高效液相色谱仪(HPLC)来进行海藻糖合成酶转化麦芽糖和蔗糖后产物的分析，分析条件，色谱柱Alltima Amino IOOA 5u 柱(4. 6mmX250mm)；检测器A1 Itech 2000ES型蒸发光散射检测器；流动相70%乙腈/30% H2O ；流速lmL/min，柱温;35°C。(1)麦芽糖为底物的反应产物分析取pH6. 5的10%麦芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液，37°C进行反应，然后用HPLC进行反应产物的分析，结果见图1，与海藻糖标样相比，麦芽糖反应样图ID出现目的产物峰，表明以麦芽糖为底物反应能生成海藻糖，反应产物有葡萄糖生成和未转化的麦芽糖。(2)蔗糖为底物的反应产物分析
取pH6. 5的10%蔗糖底物96 μ L+4 μ L酶液，37°C进行反应，然后用HPLC进行反应产物的分析，结果见图2，与海藻酮糖的标样相比，蔗糖反应样图2D出现目的产物峰，表明以蔗糖为底物反应产物中能生成海藻酮糖，反应产物中还有葡萄糖和果糖的生成，以及未转化的蔗糖。(3)最适反应pH值的分析 分别取96 μ L用不同pH的磷酸盐缓冲液配制10%的麦芽糖底物+4 μ L的酶液(蛋白含量达4yg)，在37°C反应lh，然后用HPLC分析反应的产物组分，以反应产物中的海藻糖含量来代表酶活力。不同PH对酶活力的影响结果如图3所示，表明酶的最适反应pH在 6. 0 7. 5。(4)最适反应温度测定取pH6. 5的10%麦芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液(蛋白含量达4 μ g)，在不同的反应温下保温反应lh，然后用HPLC分析反应的产物组分，以反应产物中的海藻糖百分含量来代表酶活力。不同温度对酶活力的影响结果如图4所示，表明酶的最适反应温度为35 45°C。(5)金属离子对酶活的影响取pH6. 5的10 %麦芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液(蛋白含量达4 μ g)+10 μ L金属离子(使金属离子终浓度为5mmol/L)，在37°C下反应lh，按底物的消耗量来反映酶活力的变化，以加磷酸盐缓冲液的酶活力为100%，不同金属离子对酶活力的影响结果如图5所示， 表明在5m mol/L的浓度的条件下，Ni2+, Fe3+, Mn2+，Mg2+，Ca2+等二价金属离子对该酶的活力没有抑制作用，Fe2+, Zn2+, Cu2+对该酶的活力有部分抑制作用，损失15%左右的酶活力。(6)不同反应时间，产物中各种糖含量变化取96 μ L的10 %麦芽糖底物(ρΗ6. 5) +4 μ L酶液(蛋白含量达4 μ g)，在37 °C下反应不同的时间，然后分析反应产物中各种糖的含量，以反应产物中的海藻糖含量高低来表示酶的最适合反应时间。不同时间对产物中各种糖含量的影响结果如图6所示，表明以 10%麦芽糖为底物反应100分钟左右海藻糖含量就可以达到最高，含量可以达到70%以上。(7)不同酶量，反应1小时后产物中各糖含量用IOOmM的磷酸盐缓冲液(pH7. 0)配制1 %的麦芽糖底物，反应体积为 IOOul (80ul底物+不同的酶量+缓冲液)在37°C下反应Ih,煮沸5min,离心，用HPLC测定反应后各糖的含量变化，结果如图7。表明添加酶达到一定浓度后，反应产物中海藻糖含量达到最高，继续添加过量的酶会降低海藻糖的含量，葡萄糖副产物会增加。(8)以蔗糖为底物反应不同时间产物中各糖含量以蔗糖为底物pH6.5，35°C反应不同的时间，分析产物中各糖含量结果见图8，结果表明随着反应时间的延长，产物中海藻酮糖的含量会提高，可以达到80%以上。4、从麦芽糖浆制备海藻糖取市售以淀粉制备麦芽糖含量约为70 %的麦芽糖浆，用5mM，pH为6. 5磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液配制成含30%麦芽糖的反应底物(pH为6. 5左右)，取100升配制好的反应底物放置于不锈钢反应罐中，取上述第2步方法制得的海藻糖合成酶粗酶液 10升，加入到100升含30%麦芽糖的反应底物中，然后在37°C条件下反应M小时，然后用 HPLC对反应产物进行分析，结果如表1
表1 :30%麦芽糖底物反应M小时后反应液中各组分含量(％ )
权利要求
1.一种弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.根据权利要求1所述弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其分子量为 69. 35kD，等电点为PI = 4. 7，酶的适合反应温度为35 45°C，酶的适合反应pH在6. 0 7. 5。
4.根据权利要求1所述弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶，其具有将麦芽糖转化成海藻糖或将蔗糖转化生成海藻酮糖的能力。
5.权利要求1所述的海藻糖合成酶在转化麦芽糖生产海藻糖或者海藻酮糖中的应用， 其特征在于，包括以下步骤1)将海藻糖合成酶基因构建基因工程菌进行藻糖合成酶的高效表达；2)收集制备重组的海藻糖合成酶；3)以麦芽糖或者淀粉制备的麦芽糖浆为原料用海藻糖合成酶制造海藻糖，或者以蔗糖为原料用海藻糖合成酶制造海藻糖。
全文摘要
一种弯曲高温单孢菌海藻糖合成酶基因及其应用，该基因克隆自弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)，它表达的海藻糖合成酶具有两种不同的转化功能，该酶在正常的生化反应条件下可以将麦芽糖转化成海藻糖，也能将蔗糖转化生成海藻酮糖。该基因可以应用于转化麦芽糖生产海藻糖，也可以用于转化蔗糖生产海藻酮糖。这种海藻糖和海藻酮糖都可应用于食品工业、饮料和功能性食品、美容化妆品、医药生物制品等领域。
文档编号C12N15/52GK102154327SQ20101061483
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者杜丽琴, 梁甲元, 韦宇拓, 黄日波 申请人:广西大学