专利名称：一种人阴离子胰蛋白酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种人阴离子胰蛋白酶(人胰蛋白酶幻突变体。
背景技术：
胰蛋白酶(Trypsin，EC3. 4. 21. 4)在胰脏中以作为酶的前体胰蛋白酶原的形式被合成，并作为胰液的成分而分泌，受肠激酶的酶解或胰蛋白酶的自身激活成为活性胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用， 是特异性最强的蛋白酶，在蛋白质测序中是重要的工具酶。人体胰腺的分泌液包含两种主要的胰蛋白酶原形式，阳离子型(pi > 6. 8)胰蛋白酶原-1和阴离子型(Pl < 6. 8)胰蛋白酶原-2。二者均由247个氨基酸组成，包括15个氨基酸的信号肽和8个氨基酸的活化肽。前者在胰腺内丰度最高，但自激活能力弱；后者丰度略低，但自激活能力很强。尽管这两个蛋白氨基酸序列的相似性高达89%，但是与胰蛋白酶抑制剂的反应具有一定的差异，并且表现出单克隆抗体结合的不同表位。正是由于胰蛋白酶是活性强的肽链内切酶，可水解暴露在蛋白表面的赖氨酸和精氨酸残基的羧基端形成的肽键，包括其自身会自身水解。例如其存在N29I突变，将阻止其他分子接近胰蛋白酶的自溶位点，致使其不能自溶。而人胰蛋白酶-2与胰蛋白酶-1序列不同，第四位氨基酸就是He。胰蛋白酶适应性广，在医药、轻工业及科学研究等方面都具有广泛的应用价值。胰蛋白酶可以作为蛋白水解酶类药物大量应用于医药行业中。它能够将变性蛋白水解成多肽或氨基酸，有效提高组织通透性，从而抑制浮肿及血栓周围的炎症反应，加快局部药液的扩散和吸收速率，而人体血清内含非特异性的胰蛋白酶抑制物，所以胰蛋白酶不会损伤正常组织，可大量用于溃疡、脓肿、血肿、炎症及坏死性创伤等辅助治疗。眼科上已经用于治疗各种眼部炎症、出血性眼病以及眼外伤等，用以促进瘀血、渗出液及坏死组织的消退，加快水肿和炎症的消失，缩短恢复期。但由于天然酶的活性低、稳定性差，其应用受到了一定的局限。通过突变解决其稳定性的问题，同时提高其活性是一个非常好的方法，同时，可以克服其应用的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具强的蛋白酶解能力的、稳定性提高的重组人阴离子胰蛋白酶突变体。在本发明的第一方面，提供一种重组的人阴离子胰蛋白酶突变体，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO 2氨基酸序列的第122位由Arg突变为Leu。在另一优选例中，所述的重组人阴离子胰蛋白酶突变体是(a) SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的蛋白；或
(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸(如1-10 个，较佳地1-5个，更佳地1-3个)且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白， 且其氨基酸序列的第122位为Leu。在另一优选例中，所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的适宜pH为6 11. 5 ；更佳的 pH为7 11 ；最佳的pH为10。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(i)编码所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的蛋白。在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种生产所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的方法，包括步骤(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的人阴离子胰蛋白酶突变体。在本发明的另一方面，提供所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的用途，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质。在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含所述的人阴离子胰蛋白酶突变体， 以及与所述人阴离子胰蛋白酶突变体相容的载体(如水或缓冲液)。在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于酶解蛋白质或变性蛋白质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、突变hTg2(R122L)表达鉴定。其中，1 诱导前；2 诱导后；3 超声破碎后上清；4 超声破碎后沉淀。图2、CM-FF的洗脱曲线。图3、mhT2(R122L)与野生型(WT)的非还原电泳结果，反映了两者的构型差异。图4、mhT2 (R122L)的最适pH测定。左图突变型mhT2的pH稳定性；右图野生型hT2的pH稳定性。图5、mhT2(R122L)的最适温度测定。上图突变型hT2的最适温度下图；下图野生型hT2的最适温度。图6、mhT2 (R122L)的温度稳定性。上图突变型mhT2的温度稳定性；下图野生型hT2的温度稳定性。图7、酶与底物的亲和力Km值的测定。其中，ν代表反应速度，[S]代表底物浓度， 反应条件:25mM Tris-HCl 缓冲液，pH7. 6,0. IM NaCl,0. OlM CaCl2，温度25°C。上图突变体米氏常数；下图野生型米氏常数。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，获得了一种具强酶解能力的人阴离子胰蛋白，与野生型相比，该突变体不易发生自降解，具有更强的酶解能力，与底物的结合力更强，且对于恶劣环境(如重金属离子环境)的耐受能力更强。在此基础上完成了本发明。如本文所用，除非另外说明，所述的“人阴离子胰蛋白酶突变体”、“突变蛋白 R122L”、“突变体 R122L”、“mhTg2 (R122L) ”、“R122L”、“突变的 hTg2 (R122L) ”等可互换使用， 均是指氨基酸序列对应于SEQ ID NO 2氨基酸序列的第122位由Arg突变为Leu的蛋白。若需要表示野生型的蛋白，其将被标示为“野生型人阴离子胰蛋白酶”、“hTg2”或 “野生型蛋白”，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2。如本文所用，所述的“人阴离子胰蛋白酶(或突变体)活性”是以酶的活力单位来定义的。酶的一个活力单位(IU)定义为25°C，pH7. 6条件下，反应体系3. Oml (1cm光路)，每分钟酶解 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-arginine ethyl ester, BAEE)使 253nm 下的吸收值增加0. 001定义为一个BAEE单位。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的人阴离子胰蛋白酶突变体”是指人阴离子胰蛋白酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人阴离子胰蛋白酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括所述人阴离子胰蛋白酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人阴离子胰蛋白酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 然而，所述的人阴离子胰蛋白酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO 2氨基酸序列的第122位的氨基酸为Leu。在本发明中，术语“人阴离子胰蛋白酶突变体”指具有本发明的人阴离子胰蛋白酶突变体活性的SEQ ID NO :4序列的蛋白。该术语还包括具有与人阴离子胰蛋白酶突变体相同功能的、SEQ ID NO :4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1_2个)氨基酸的缺失、 插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内， 较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人阴离子胰蛋白酶突变体的活性片段和活性衍生物。最好的，在这些SEQ ID NO :4的变异形式中，第122位的氨基酸为 Leu0蛋白的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人阴离子胰蛋白酶突变体DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人阴离子胰蛋白酶突变体的抗血清获得的蛋白或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含人阴离子胰蛋白酶突变体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白外，本发明还包括了人阴离子胰蛋白酶突变体的可溶性片段。通常，该片段具有人阴离子胰蛋白酶突变体序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50 个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供人阴离子胰蛋白酶突变体或蛋白的类似物。这些类似物与天然人阴离子胰蛋白酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解， 本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。在本发明中，“人阴离子胰蛋白酶突变体保守性变异蛋白”指与SEQ ID NO 4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如1个、 2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种重组的人阴离子胰蛋白酶突变体，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO :2氨基酸序列的第122位由Arg突变为Leu。
2.如权利要求1所述的重组人阴离子胰蛋白酶突变体，其特征在于，其是(a)SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白，且其氨基酸序列的第122位为Leu。
3.如权利要求1所述的人阴离子胰蛋白酶突变体，其特征在于， 所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的适宜pH为6 11. 5。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(i)编码权利要求1所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的多核苷酸；或 ( )与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求4任一所述的多核苷酸。
7.—种生产权利要求1所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的方法，其特征在于，包括步骤(1)培养权利要求6所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离权利要求1所述的人阴离子胰蛋白酶突变体。
8.权利要求1所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的用途，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质。
9.一种组合物，其包含权利要求1所述的人阴离子胰蛋白酶突变体，以及与所述人阴离子胰蛋白酶突变体相容的载体。
10.权利要求9所述的组合物的用途，用于酶解蛋白质或变性蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种新的人阴离子胰蛋白酶突变体及其编码基因。本发明还公开了含有所述编码基因的载体及宿主细胞。本发明的人阴离子胰蛋白酶突变体不易发生自降解，具有更强的酶解能力，与底物的结合力更强，且对于恶劣环境的耐受能力更强。
文档编号C12N5/10GK102559645SQ20101061413
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者冯矗, 李素霞, 赵致 申请人:上海雅心生物技术有限公司