专利名称：一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法
技术领域：
本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，属于材料、生物、和分析化学交叉学科的技术领域，具体涉及到一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法的技术方案。
背景技术：
胰蛋白酶是蛋白质分解中最重要的消化酶之一，胰蛋白酶原的分泌、活化、抑制以及循环的不平衡会导致急性或慢性的胰腺疾病，严重的例如胰腺癌。胰腺癌是恶性度最高、预后最差的一种肿瘤，患者的5年生存率一般不到5%，大约每年有35000例胰腺癌是由于丝氨酸蛋白酶尤其是胰蛋白酶的不平衡引起的。此外胰蛋白酶不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。目前发展起来的测定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、荧光法、免疫法、放射性元素标记法、质谱法(MS)、液相色谱法(HPLC)、电泳法等。紫外法和比色法操作简单，但灵敏度低，重现性差。免疫法灵敏度高，如专利201020245770. X所述，但由于单克隆抗体的使用使得成本也高，且需要一定的操作技术。放射性元素标记法需要对底物进行标记，制备复杂并且有一定的安全性问题等等。质谱仪器昂贵，对样品的纯度要求高，色谱以及电泳法需要比较复杂的操作和较长的检测时间。相比这些方法，荧光法操作简便、灵敏度高、可实现实时监测，具有临床应用的潜在可能。但一般的荧光法需要荧光标记底物，制备复杂且提高了成本，使其应用受到限制，近年来无标记的方法受到关注。目前报道的无标记荧光检测的方法主要是应用水溶性荧光共轭聚合物以及新型的聚集诱导发光分子，这些分子的合成与分离仍然比较复杂。因而建立试剂易得，制备简单的荧光检测方法具有重要的意义。通过检索，未见无标记荧光检测胰蛋白酶的方法。
发明内容
本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、快速、灵敏、无须有机合成的无标记荧光检测胰蛋白酶方法。本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于是一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法，其具体步骤为
I配制荧光探针的有机溶液
以疏水染料为荧光探针，将疏水染料溶解到市售光谱纯丙酮、氯仿或甲醇的有机溶剂中，配制浓度为10_3 10_6mol L—1荧光探针的有机溶液；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC:
将表面活性剂溶解于浓度为10 mM,pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，配制浓度范围为ImolL—卜KTmol L—1的梯度溶液，用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，加入到梯 度溶液中，使梯度溶液中探针的终浓度为10_8 10_6 mo I L—1，以4(Tl00kHz敞口超声波处理1(T60分钟，静置0. 5^12小时后进行荧光光谱检测，测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC ；
III配制超分子组装体溶液
根据步骤II得到的表面活性剂的临界胶束浓度CMC，确定表面活性剂浓度为
0.f I. 6CMC，将带相反电荷的聚电解质溶解于浓度为10 mM,pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中制成聚电解质溶液；按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1，在表面活性剂的溶液中加入等体积的聚电解质溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用形成超分子组装体，混合均匀，静置1(T15分钟，得到超分子组装体溶液，该超分子组装体溶液的重量百分浓度为0. OfO. 2%；
IV配制检测液 再次用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，分别加入到III所得到的超分子组装体溶液中，使该超分子组装体溶液中探针的终浓度为10_8 IO-6Hi0I L—1，以4(Tl00kHz敞口超声波处理10飞0分钟，静置0. 5^12小时后得到检测液；
V测定催化水解时间
步骤IV得到的检测液在35 37°C下培养10 15分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mM,pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积的胰蛋白酶缓冲溶液，以只加入缓冲溶液作为空白对照，胰蛋白酶终浓度范围为0.0广100 mL—1，在35 37°C下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围；
VI测定胰蛋白酶活性
根据步骤V得到的时间范围，取各浓度条件下共同线性时间范围的最大值，以荧光发射峰强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。上述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的疏水染料为市售纯度高于98%的芘、尼罗红、香豆素481、苏丹红或氟硼荧染料B0DIPY，氟硼荧染料BODIPY是指 BODIPY FL,BODIPY R6G、BODIPY TMR,BODIPY 581/591、BODIPY TR 或BODIPY 630/650。上述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的表面活性剂为带负电荷的烷基硫酸盐或烷基磺酸盐，烷基硫酸盐为市售分析纯十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；烷基磺酸盐为市售分析纯十二烷基磺酸钠、十四烷基磺酸钠或十TK烧基横酸纳。上述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的聚电解质是可以被胰蛋白酶催化水解的多肽，多肽为市售纯度高于99%的，长度为1(T16的带正电荷的精氨酸序列 Arg10 Arg16O本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶活性的方法与现技术相比具有的有益效果:
1)通过超分子组装体解组装的方式进行检测，不需要复杂的有机合成和固定过程，制备简单、成本低、无污染；
2)在超分子组装体内部包埋荧光染料，通过荧光方法进行检测，灵敏度高，检测时间短，容易实现实时检测。
图I是表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)的临界胶束浓度测定曲线；
图2是表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)分别与不同长度的多肽(Argltl与Arg6)组装行为的差异。
具体实施例方式以疏水染料作为荧光探针，首先测定了表面活性剂的临界胶束浓度，然后在表面活性剂临界胶束浓度以下，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用形成超分子组装体，疏水染料包埋于组装体内腔，最后加入对聚电解质有水解作用的酶，将高分子量的聚电解质催化水解为低分子量的聚电解质，诱导组装体解组装，使组装体内腔包埋的荧光探针释放，通过荧光强度的降低来实现酶活性的检测。下面的实施方式是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。实施方式I:
I配制荧光探针的有机溶液
以芘为荧光探针，将芘溶解到丙酮中，在10 HiL容量瓶中配制浓度为10_2 mo I L—1芘的丙酮溶液，进一步用丙酮稀释到10_5 mol L-1 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC:
将十二烷基硫酸钠SDS溶解于浓度为10 mM, pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在10 mL容量瓶中配制10_2 mol L—1的溶液，进一步用缓冲液做倍比稀释，得到浓度范围为ImolL-1 10_7mOl L-1的梯度溶液；
用微量进样器移取步骤I配制得到的荧光探针的有机溶液，分别加入到配制的梯度溶液中，使梯度溶液中荧光探针的终浓度为5 X KTmol L—1。以IOOkHz敞口超声波处理10分钟，静置0. 5小时后检测荧光激发光谱。以荧光激发光谱1338/1333的比值对表面活性剂浓度的对数值作图，拟合得到s型曲线，曲线的第一个突变点对应浓度即为表面活性剂的临界胶束浓度。荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
确定表面活性剂浓度为0. 6 CMC，将Argltl溶解于浓度为10 mM, pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1加入等体积的Argltl的缓冲溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用构建超分子组装体，混合均匀，静置10分钟，得到组装体溶液，组装体溶液的重量百分浓度为0. 075% ；
IV配制检测液
再次用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，分别加入到III所得到的组装体溶液中，使组装体溶液中荧光探针的终浓度为5X 10_7mol L'以IOOkHz敞口超声波处理10分钟，静置0. 5小时后得到检测液；
V测定催化水解时间
步骤IV得到的检测液中在35°C下培养10分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mM, pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积不同浓度的胰蛋白酶，以加入缓冲溶液作为空白对照，浓度范围从0.01到100呢mL—1，在35°C下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围；
VI测定胰蛋白酶活性
根据步骤V得到的时间范围，取各浓度条件下共同线性时间范围的最大值，以荧光发射峰强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。荧光强度下降的比率为(I-Iq)Aq XlOO %，I。代表只加缓冲溶液的空白对照荧光发射峰处荧光强度，I代表加入不同浓度胰蛋白酶后发射峰处荧光强度。荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。
特异性实验在相同测试条件下，在组装体溶液中分别加入相同浓度的碱性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶，37°C下培养半小时后进行荧光光谱检测。荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式2
I配制荧光探针的有机溶液
以尼罗红为荧光探针，将尼罗红溶解到甲醇中，在10 mL容量瓶中配制浓度为KT1 molL—1尼罗红的甲醇溶液，进一步用甲醇稀释到10_3 mol L-1 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC:
将十四烷基硫酸钠溶解于浓度为10 mM,pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，在10 mL容量瓶中配制10_2 mol L—1的溶液，进一步用缓冲液做倍比稀释，得到浓度范围为lmol d0_7mOlL-1的梯度溶液；
用微量进样器移取步骤I配制得到的荧光探针的有机溶液，分别加入到配制的梯度溶液中，使梯度溶液中荧光探针的终浓度为10_6 mol L'以70 kHz敞口超声波处理30分钟，静置I小时后检测荧光激发光谱。以荧光发射光谱发射峰强度对表面活性剂浓度对数值作图，拟合得到s型曲线，曲线的第一个突变点对应浓度即为表面活性剂的临界胶束浓度。荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
固定表面活性剂浓度为0. 1CMC，将Arg16溶解于浓度为10 mM, pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1加入等体积的Arg16的缓冲溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用构建超分子组装体，混合均匀，静置15分钟，得到组装体溶液，组装体溶液的重量百分浓度为0. 01% ；
IV配制检测液
再次用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，分别加入到III所得到的组装体溶液中，使组装体溶液中探针的终浓度为10_6 mol L'以70kHz敞口超声波处理30分钟，静置I小时后得到检测液；
V测定催化水解时间
步骤IV得到的检测液中在37°C下培养15分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mM, pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积不同浓度的胰蛋白酶，以加入缓冲溶液作为空白对照，浓度范围从0. 01到100呢mL—1，在37°C下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围；
VI测定胰蛋白酶活性
根据步骤V得到的时间范围，取各浓度条件下共同线性时间范围的最大值，以荧光发射峰强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。荧光强度下降的比率为(I-Iq)Aq XlOO %，I。代表只加缓冲溶液的空白对照荧光发射峰处荧光强度，I代表加入不同浓度胰蛋白酶后发射峰处荧光强度。荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验在相同测试条件下，在组装体溶液中分别加入相同浓度的碱性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶，37°C下培养半小时后进行荧光光谱检测。 荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式3
I配制荧光探针的有机溶液
以苏丹红为荧光探针，将苏丹红溶解到氯仿中，在10 mL容量瓶中配制浓度为KT1moIL—1苏丹红的氯仿溶液，进一步用氯仿稀释到10_3 mol L-1 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC:
将十六烷基硫酸钠溶解于浓度为10 mM,pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，在10 mL容量瓶中配制10_2 mol L—1的溶液，进一步用缓冲液做倍比稀释，得到浓度范围为lmol d0_7mOlL-1的梯度溶液；
用微量进样器移取步骤I配制得到的荧光探针的有机溶液，分别加入到配制的梯度溶液中，使梯度溶液中荧光探针的终浓度为10_6 mol L'以40 kHz敞口超声波处理60分钟，静置12小时后检测荧光激发光谱。以荧光发射光谱发射峰强度对表面活性剂浓度对数值作图，拟合得到s型曲线，曲线的第一个突变点对应浓度即为表面活性剂的临界胶束浓度。荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
固定表面活性剂浓度为0. 8 CMC，将Arg12溶解于浓度为10 mM, pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1加入等体积的Arg16的缓冲溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用构建超分子组装体，混合均匀，静置10分钟，得到组装体溶液，组装体溶液的重量百分浓度为0. 12% ；
IV配制检测液
再次用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，分别加入到III所得到的混合溶液中，使混合溶液中探针的终浓度为10_6 mol L'以40kHz敞口超声波处理60分钟，静置12小时后得到检测液；
V测定催化水解时间
步骤IV得到的检测液中在37°C下培养10分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mM, pH
8.0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积不同浓度的胰蛋白酶，以加入缓冲溶液作为空白对照，浓度范围从0. 01到100呢mL—1，在37°C下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围；
VI测定胰蛋白酶活性
根据步骤V得到的时间范围，取各浓度条件下共同线性时间范围的最大值，以荧光发射峰强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。
荧光强度下降的比率为(I-Ici)Atl Xioo %，Itl代表只加缓冲溶液的空白对照荧光发射峰处荧光强度，I代表加入不同浓度胰蛋白酶后发射峰处荧光强度。荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。 特异性实验在相同测试条件下，在组装体溶液中分别加入相同浓度的碱性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶，37°C下培养半小时后进行荧光光谱检测。荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式4
I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为香豆素481，其他同实施方式2 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC:
除所用表面活性剂为十二烷基磺酸钠，其他同实施方式2 ；
荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为I. 6CMC，所用聚电解质为Arg14，组装体溶液的重量百分浓度为2%，其他同实施方式I ;
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2 ；
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式5
I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为BODIPY FL，浓度为10_5mol L—1，其他同实施方式2 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC
除所用表面活性剂为十四烷基磺酸钠，荧光探针的终浓度为10_8 mol L—1，其他同实施方式2 ；
荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为0. 6CMC，所用聚电解质为Arg13，组装体溶液的重量百分浓度为0.08%，其他同实施方式I ;
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2 ；
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式6
I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为BODIPY R6G，其他同实施方式5 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC
除所用表面活性剂为十六烷基磺酸钠，其他同实施方式5 ；
荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为0. 5CMC，所用聚电解质为Arg15，组装体溶液的重量百分浓度为
0.07%，其他同实施方式I ;
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2 ；
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式7
I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为BODIPY TMR，其他同实施方式5 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC
除荧光探针的终浓度为10_7 mol L—1，其他同实施方式2 荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为0. 9CMC，所用聚电解质为Arg11,组装体溶液的重量百分浓度为
0.12 %，其他同实施方式I ;
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2 ；
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式8 I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为BODIPY 581/591，其他同实施方式5 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC
除荧光探针的终浓度为10_7 mol L—1，其他同实施方式3 ；
荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为CMC，所用聚电解质为Arg16，其他同实施方式1，组装体溶液的重量百分浓度为0. 15%，；
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2;
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式9
I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为BODIPY TR，其他同实施方式5 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC
除荧光探针的终浓度为10_7 mol L—1，其他同实施方式4 ;
荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为I. 2CMC，所用聚电解质为Arg14，其他同实施方式1，组装体溶液的重量百分浓度为0. 15%，；
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2 ；
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。实施方式10I配制荧光探针的有机溶液
除所用荧光探针为BODIPY 630/650，其他同实施方式5 ；
II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC :同实施方式5 ；
荧光光谱测定得到表面活性剂的临界胶束浓度。III配制超分子组装体溶液
除表面活性剂浓度为0. 4CMC，所用聚电解质为Arg12，组装体溶液的重量百分浓度为0. 05%，其他同实施方式I ;
IV配制检测液同实施方式2;
V测定催化水解时间同实施方式2 ；
VI测定胰蛋白酶活性同实施方式I ;
荧光光谱检测结果表明发射峰位置荧光强度下降比率与胰蛋白酶浓度有很好的线性关系。特异性实验
荧光光谱检测结果表明组装体系对胰蛋白酶检测有很好的特异性，其他蛋白不会影响检测。
权利要求
1.一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于是一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法，其具体步骤为 I配制荧光探针的有机溶液 以疏水染料为荧光探针，将疏水染料溶解到市售光谱纯丙酮、氯仿或甲醇的有机溶剂中，配制浓度为10_3 10_6mol L—1荧光探针的有机溶液； II测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC: 将表面活性剂溶解于浓度为10 mM,pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，配制浓度范围为ImolL—卜KTmol L—1的梯度溶液，用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，加入到梯度溶液中，使梯度溶液中探针的终浓度为10_8 10_6 mo I L—1，以4(Tl00kHz敞口超声波处理10^60分钟，静置0. 5^12小时后进行荧光光谱检测，测定表面活性剂的临界胶束浓度CMC ； III配制超分子组装体溶液 根据步骤II得到的表面活性剂的临界胶束浓度CMC，确定表面活性剂浓度为0. f I. 6CMC，将带相反电荷的聚电解质溶解于浓度为10 mM,pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中制成聚电解质溶液；按照聚电解质与表面活性剂电荷比为1:1，在表面活性剂的溶液中加入等体积的聚电解质溶液，表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用形成超分子组装体，混合均匀，静置1(T15分钟，得到超分子组装体溶液，该超分子组装体溶液的重量百分浓度为0.0广0. 2%； IV配制检测液 再次用微量进样器移取步骤I配制的荧光探针有机溶液，分别加入到III所得到的超分子组装体溶液中，使该超分子组装体溶液中探针的终浓度为10_8 IO-6Hi0I L—1，以4(Tl00kHz敞口超声波处理10飞0分钟，静置0. 5^12小时后得到检测液； V测定催化水解时间 步骤IV得到的检测液在35 37°C下培养10 15分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mM,pH 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积的胰蛋白酶缓冲溶液，以只加入缓冲溶液作为空白对照，胰蛋白酶终浓度范围为0. OflOO mL—1，在35 37°C下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围； VI测定胰蛋白酶活性 根据步骤V得到的时间范围，取各浓度条件下共同线性时间范围的最大值，以荧光发射峰强度下降的比率对加入胰蛋白酶浓度作图，得到检测标准曲线。
2.按照权利要求I所述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的疏水染料为市售纯度高于98%的芘、尼罗红、香豆素481、苏丹红或氟硼荧染料B0DIPY，氟硼荧染料BODIPY是指BODIPY FL,BODIPY R6G、B0DIPY TMR、B0DIPY 581/59UB0DIPY TR或BODIPY630/650。
3.按照权利要求I所述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的表面活性剂为带负电荷的烷基硫酸盐或烷基磺酸盐，烷基硫酸盐为市售分析纯十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；烷基磺酸盐为市售分析纯十二烷基磺酸钠、十四烷基磺酸钠或十六烷基磺酸钠。
4.按照权利要求I所述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的聚电解质是可以被胰蛋白酶催化水解的多肽，多肽为市售纯度高于99%的，长度为1(T16的带正电荷的精氨酸序列Arglt T Arg16。
全文摘要
一种无标记荧光检测胰蛋白酶的方法，属于材料、生物、和分析化学交叉学科的技术领域，具体涉及到一种基于超分子组装体在酶催化水解作用下解组装来实现胰蛋白酶检测的方法的技术方案。其特征在于是首先测定表面活性剂的临界胶束浓度，然后在表面活性剂临界胶束浓度以下，由表面活性剂与带相反电荷的聚电解质通过疏水与静电作用形成超分子组装体，疏水染料作为荧光探针包埋于组装体内腔，最后加入对聚电解质有水解作用的酶，诱导组装体解组装，使包埋的疏水染料释放，通过荧光强度的降低来实现酶活性的检测。这种方法制备简单、成本低、可实现实时检测，在生物分子的诊断与检测、生物传感器等领域具有广泛的应用前景。
文档编号G01N21/75GK102680442SQ20121011607
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者刘晓华, 朱晶心, 贾兰 申请人:太原理工大学