专利名称：一种荧光标记效率检测的方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，涉及基因芯片技术，尤其涉及一种荧光标记效率的检测方法。
基因芯片是九十年代发展起来的一项前沿生物技术。随着生物技术的迅猛发展，20世纪人类最宏伟的计划之一—人类基因组计划预计将提前至2003年完成，届时人类将完成25种染色体(22种常染色体，2种性染色体和1种线粒体染色体)共计30亿对碱基的序列测定，以及小鼠、果蝇、线虫等模式生物的全基因组序列的测定。人类基因组计划将由此进入后基因组时代，研究的重点将由发现基因转向发现基因的功能。人们将逐步阐明从基因到蛋白再到生命现象这一过程的奥秘。如何大规模研究人类约10万条基因的功能，特别是基因相互作用和调控关系，迫切需要一种新的方法能以大规模、高通量的方式进行成千上万个基因在各种生理状态下表达状况的研究。传统的Northern blot杂交或点杂交方法，以及以电泳为基础的基因表达、序列测定、突变和多态性分析等研究方法显然不能适应上述的要求。基因芯片技术由此应运而生。
基因芯片技术由此应运而生。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500μm)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片，也叫基因微矩阵(Microarray)。基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。基因芯片的概念可追溯到southern blot杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出northern blot杂交和点杂交技术。.这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。
美国affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics13,1008-1017.)。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描(U.S Patent 5981965)和计算机分析(U.S Patent 5974164)等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片(Baldwin,D等(1999)Curr Opin Plant Biol 2(2):96-103.)。
有鉴于基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点，目前世界上许多国家和地区都已着手进行基因芯片的研制和开发工作。美国政府于1998年正式启动基因芯片计划，NIH、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne,Oakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。
目前的基因微矩阵芯片技术包含以下几个关键步骤及流程PCR制备靶基因，点样及固定，探针制备，杂交，检测与分析。基因芯片技术中，探针标记是指通过PCR或逆转录等方法，掺入经过荧光基团修饰的碱基(如dCTP、dUTP)，形成带有荧光标记的DNA探针。探针的标记效率是表达谱芯片技术中较为关键的因素。基因芯片中常用标记方法有反转录法和PCR法，也可以用随机引物法或缺口转移(NickTranslation)法。以反转录法为例，表达谱芯片通常以来源不足的少量mRNA为模板，通过反转录得到带有荧光标记的cDNA探针，其标记的效率的高低对杂交的结果影响很大。如果效率较低，则不得不使用较高的扫描强度扫描杂交结果，这时背景等干扰因素就会相应增加。所以需要有检测荧光标记效率的方法，监控反转录后产物的荧光强度，为提高反转录标记的效率提供可靠的数据。
目前，有关基因芯片技术中缺乏有效的荧光探针标记效率检测方法，仅有的一篇报道是将适量标记后的探针进行常规琼脂糖凝胶电泳，然后将凝胶用特殊的荧光扫描仪扫描，可半定量测得探针的荧光强度。
由于常规琼脂糖凝胶电泳将引入难以克服的误差如电泳中荧光带的扩散或脱尾问题等，这种方法对探针的检测不够可靠。而且该方法除了使用芯片荧光扫描仪，还需用价格昂贵的荧光扫描仪，故而这种方法的实用性不高。我们发明的标记效果检测的方法可靠易行，不需要特殊仪器，相对其他的检测方法有较大的优越性。
本发明的目的在于寻找一种可靠的探针标记效率的检测方法，为指导标记方法的改进提供参考的数据，并监控芯片杂交体系，提高成功率。本发明的构思是这样的总的思路是通过检测探针的荧光信号值(F)，确定含有荧光基团的单核苷酸量(s)，并以此计算出该种核苷酸的总量(n)，最终可获得探针DNA的量(w)。具体如下1．探针的荧光值F与其含有荧光基团量成正比，已知探针的荧光值根据标准曲线法或掺入率法推算，即可推出其含有荧光基团的单核苷酸量s(摩尔单位)。
2．通常DNA分子中，不含荧光基团的某单核苷酸与荧光基团的该种单核苷酸的比例为m×k,k为不含荧光基团的某种单核苷酸与含荧光基团的该种单核苷酸掺入DNA中的速度之比，m为反应体系中不含荧光基团的单核苷酸与含荧光基团的单核苷酸两种底物浓度之比。因而标记的核酸产物中该种核苷酸的总量n=(mk+1)×s(单位，摩尔单位)。其中k与反应过程中使用的酶的种类和荧光物质的种类有关。
3．总DNA中的四种单核苷酸含量基本相同，即可得探针DNA的量w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s，(公式1)。单位为质量单位(324.5为各碱基的近似分子量)。
4．用总的探针的质量(w)除以模板mRNA或DNA的质量(r)，比值即标记效率e，e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％,(公式2)。
探针标记效率的检测，对于PCR反应，只需计算出w值，即可表示标记效率的高低；而对于逆转录(包括循环逆转录)、随机引物法或缺口转移(NickTranslation)法，用e值表示标记效率更好。本发明亦是这样实现的依据本发明构思，标记效率e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％。在PCR法中，以探针DNA的总量w表示标记效率，w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s。为了计算w或e值，对于某一种标记反应，k是常数，与酶和荧光分子的种类有关，可通过常规实验或分子生物学实验技术手册获得；m和r是已知的，因此只需测定s值即可计算w或e值。可用以下技术方案测得s值。1．标准曲线法推算s值将一系列不同浓度的荧光基团修饰的某种单核苷酸点于玻片上，用基因芯片荧光扫描仪扫描，计算单位体积的荧光信号总量F(F1-Fn)，绘制F--荧光单核苷酸摩尔浓度(以c表示，c1-cn)标准曲线(在仪器的线性工作范围内，F与c成正比)，并计算标准曲线的斜率K。取适量经纯化后的荧光探针经适当稀释点于玻片上，用同样的扫描强度扫描，对照标准曲线以单位体积的荧光信号总量F找到荧光单核苷酸的浓度c，或根据斜率计算c=K×F(注标准曲线或K值可以反复使用，只需保证待测样品用同一扫描仪及同样的扫描强度)。
经纯化后的荧光探针样品的体积以v表示，则掺入探针的荧光单核苷酸总量s(摩尔量)，s=Dxc×v(D为稀释倍数)。已知s值后，根据公式1(w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s)和公式2(e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％),即可计算w或e值。2．掺入率法推算s值取一定体积未纯化的探针及同样体积的纯化后探针分别点于干净的玻片上，扫描，并从下面的公式算出掺入率(I)(参考《分子克隆》中放射性探针标记掺入率的计算方法(金冬雁等译《分子克隆实验指南》(第二版)，(1992),963-964。):
I=[(Fa×Da)/(Fb×Db)]×100％I-掺入率Fb-纯化前荧光值Fa-纯化后荧光值
Db-纯化前稀释倍数Da-纯化后稀释倍数已知纯化前反应液中荧光单核苷酸的总量S0(单位为摩尔量)，则掺入探针cDNA中的荧光单核苷酸的量s=S0×I。根据公式1(w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s)和公式2(e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％)，即可计算w或e值。
通过上述两种方法，即可对各种类型的荧光标记效率进行检测。我们的实验证明，对于逆转录酶SuperscriptⅡ，以荧光物质Cy3或Cy5标记时，k值都为1，即含有荧光基团Cy3或Cy5的单核苷酸与不含荧光基团的单核苷酸掺入探针DNA链的机会基本均等；而在使用Taq酶的PCR反应中，使用Cy3或Cy5标记时，k值为10。同时，荧光物质为Cy3或Cy5时标记效率的检测也完全适用上述技术方案所公开的方法，因此，由于此时k值为已知值，标记效率的检测将更为简便。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1在表达谱芯片的制备中逆转录荧光探针标记效率的检测探针标记效率以e表示，以荧光基团cy3为标记物，荧光基团(cy3)单核苷酸与该种单核苷酸渗入DNA的速度之比k为11．标准曲线法用逆转录法将cy3-dCTP掺入到探针中，通过MicroSpinS-200 HR纯化柱(Amersham Pharmacia公司)或其他纯化方法以去除未掺入的单核苷酸。
将cy3-dCTP的原液(1mmol/l)以5000,10000,20000,30000,40000,…,240000,250000倍作等差稀释，分别各取1μl分6个点点于干净的玻片上，用ScanArray 3000激光扫描仪以PMT 90,Laser Power 90扫描，统计各点的荧光强度，计算出各稀释度6点荧光值的总和，以各稀释度的总荧光强度值为x轴，cy3-dCTP的浓度为y轴绘制标准曲线。取少量纯化后的探针以50倍稀释后，取1μl分6点点于干净的玻片，扫描后计算荧光值的总和，依据标准曲线查出cy3-dCTP的浓度c，因为s=50×c×v，根据公式2:e=(1298×(1×m+1)×s/r)×100％，则可以求出e值。
2．掺入率法用逆转录法将cy3-dCTP掺入到探针中，通过MicroSpinS-200 HR纯化柱(AmershamPharmacia公司)或其他纯化方法以去除未掺入的单核苷酸。
纯化前的探针稀释10000倍，纯化后的探针稀释50倍，各取1μl分6点点于玻片，根据I=[(Fa×50)/(Fb×10000)]×100％计算出掺入率I，已知纯化前反应系统中cy3-dCTP的总量摩尔数S0，则可求出s=S0×I，根据公式2:e=(1298×(1×m+1)×s/r)×100％，则可以求出e值。
实施例2在PCR诊断芯片的制备中荧光探针标记效率的检测标记效率用w表示，以荧光基团cy5为标记物，荧光基团(cy5)单核苷酸与该种单核苷酸渗入DNA的速度之比k为101．标准曲线法用PCR法将cy5-dCTP掺入到探针中，通过MicroSpinS-200 HR纯化柱(AmershamPharmacia公司)或其他纯化方法以去除未掺入的单核苷酸。
将cy5-dCTP的原液(1mmol/l)以5000,10000,20000,30000,40000,…,240000,250000倍作等差稀释，分别各取1μl分6个点点于干净的玻片上，用ScanArray 3000激光扫描仪以PMT 90,Laser Power 90扫描，统计各点的荧光强度，计算出各稀释度6点荧光值的总和，以各稀释度的总荧光强度的为x轴，cy5-dCTP的浓度为y轴绘制标准曲线。取少量纯化后的探针以2倍稀释后，取1μl分6点点于干净的玻片，扫描后计算荧光值的总和，依据标准曲线查出cy5-dCTP的浓度c，因为s=2×c×v，则根据公式1可以求出w=1298×(10m+1)×s。
2．掺入率法用PCR法将cy5-dCTP掺入到探针中，通过MicroSpinS-200HR纯化柱(AmershamPharmacia公司)或其他纯化方法以去除未掺入的单核苷酸。
纯化前的探针稀释40倍，纯化后的探针稀释2倍，各取1μl分6点点于玻片，根据I=[(Fa×2)/(Fb×40)]×100％计算出掺入率I，已知标记反应共使用cy5-dCTP的摩尔数S0，则可求出s=S0×I，根据公式1可以求出w=1298×(10m+1)×s。
实施例3在循环逆转录诊断芯片的制备中荧光探针标记效率的检测标记效率用e表示，以荧光基团cy3为标记物，荧光基团(cy3)单核苷酸与该种单核苷酸渗入DNA的速度之比k为11．标准曲线法用循环逆转录法将cy3-dCTP掺入到探针中，通过MicroSpinS-200HR(AmershamPharmacia公司)或其他纯化方法以去除未掺入的单核苷酸。
将cy3-dCTP的原液(1mmol/l)以5000,10000,20000,30000,40000,…,240000,250000倍作等差稀释，分别各取1μl分6个点点于干净的玻片上，用ScanArray 3000激光扫描仪以PMT90,Laser Power90扫描，统计各点的荧光强度，计算出各稀释度6点荧光值的总和，以各稀释度的总荧光强度值为x轴，cy3-dCTP的浓度为y轴绘制标准曲线。取少量纯化后的探针以2倍稀释后，取1μl分6点点于干净的玻片，扫描后计算荧光值的总和，依据标准曲线查出cy3-dCTP的浓度c，因为s=2×c×v，根据公式2:e=((1298×(1×m+1)×s/n)/r)×100％，则可以求出e值(n为逆转录循环次数)。
2．掺入率法用循环逆转录法将cy3-dCTP掺入到探针中，通过MicroSpinS-200 HR纯化柱(Amersham Pharmacia公司)或其他纯化方法以去除未掺入的单核苷酸。
纯化前的探针稀释50倍，纯化后的探针稀释2倍，各取1μl分6点点于玻片，根据I=[(Fa×2)/(Fb×50)]×100％计算出掺入率I，已知纯化前反应系统中cy3-dCTP的总量摩尔数S0，则可求出s=S0×I，根据公式2:e=((1298×(1×m+1)×s/n)/r)×100％，则可以求出e值(n为逆转录循环次数)。
通过说明书所公开的技术方案和实施例表明，本发明与电泳法相比，具有以下优点1．仅用芯片荧光扫描仪，不需使用电泳法中价格昂贵的荧光扫描仪。
2．可以较精确地测定标记的效率，而电泳法只能定性或半定量分析标记的好坏。
3．只要一次性作出标准曲线，对于每个样品的检测操作简单，时间短，只需数分钟；而电泳法需2小时以上。
权利要求
1．一种荧光标记效率检测方法，其特征在于，通过检测探针的荧光信号值(F)，确定含有荧光基团的单核苷酸量(s)，并以此计算出该种核苷酸的总量(n)，最终可获得探针DNA的量(w)。以总的探针DNA的质量(w)、或以总的探针DNA的质量(w)除以模板mRNA或DNA的质量(r)的比值e来表示荧光标记效率，可表示为w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s及通过测得F值或s值就可知荧光标记效率；e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％。
2．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，该方法可以用于PCR法扩增中荧光标记效率的检测，荧光标记效率以最终可获得探针DNA的量(w)表示，w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s。
3．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，该方法可以用于逆转录法中荧光标记效率的检测，荧光标记效率以最终可获得探针DNA的量(w)除以模板mRNA(r)的比值e表示，e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％。
4．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，该方法可以用于循环逆转录法中荧光标记效率的检测，荧光标记效率以最终可获得探针DNA的量(w)除以模板mRNA(r)的比值e表示，e=((1298×(1×m+1)×s/n)/r)×100％,n为逆转录循环次数。
5．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，在使用逆转录酶SuperscriptⅡ的逆转录过程中，以荧光物质Cy3或Cy5标记时，k值都为1，即含有荧光基团Cy3或Cy5的单核苷酸与不含荧光基团的单核苷酸掺入探针DNA链的机会基本均等；而在使用Taq酶的PCR反应中，使用Cy3或Cy5标记时，k值为10。
6.如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，可以用标准曲线法推算s值，并以此计算w或e值，其步骤包括将一系列不同浓度的荧光基团修饰的某种单核苷酸点于玻片上，用基因芯片荧光扫描仪扫描，计算单位体积的荧光信号总量F(F1-Fn)，绘制F--荧光单核苷酸摩尔浓度(以c表示，c1-cn)标准曲线(在仪器的线性工作范围内，F与c成正比)，并计算标准曲线的斜率K。取适量经纯化后的荧光探针点于玻片上，用同样的扫描强度扫描，对照标准曲线以荧光信号总量F找到荧光单核苷酸的浓度c，或根据斜率计算c=K×F。经纯化后的荧光探针样品的体积以v表示，则掺入探针的荧光单核苷酸总量s(摩尔量)，s=c×v。已知s值后，根据公式1(w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s)和公式2(e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％),即可计算w或e值。
7．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，可以用渗入法推算s值，并以此计算w或e值，其步骤包括取一定体积未纯化的探针及同样体积的纯化后探针分别点于干净的玻片上，扫描，并从下面的公式算出掺入率(I):I=[(Fa×Da)/(Fb×Db)]×100％其中I-掺入率Fb-纯化前荧光值Fa-纯化后荧光值Db-纯化前稀释倍数Da-纯化后稀释倍数已知纯化前反应液中荧光单核苷酸的总量S0(单位为摩尔量)，则掺入探针cDNA中的荧光单核苷酸的量s=S0×I。根据公式1(w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s)和公式2(e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％)，即可计算w或e值。
全文摘要
一种对基因芯片探针标记效率的检测方法,通过检测探针的荧光信号值(F),确定含有荧光基团的单核苷酸量(s),并以此计算出该种核苷酸的总量(n),最终可获得探针DNA的量(w)。以总的探针DNA的质量(w)、或以总的探针DNA的质量(w)除以模板mRNA或DNA的质量(r)的比值e来表示荧光标记效率,可表示为:w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s;e=(w/r)×100%=(1298×(mk+1)×s/r)×100%。本发明为指导基因芯片荧光标记方法的改进提供参考的数据,并可用作监控芯片杂交体系,以提高荧光标记的成功率。
文档编号G01N21/64GK1314587SQ00114999
公开日2001年9月26日 申请日期2000年3月20日 优先权日2000年3月20日
发明者毛裕民, 谢毅, 李瑶 申请人:上海博道基因开发有限公司