一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法与流程

本发明涉及分子细胞遗传学领域，特别是涉及大麦染色体原位杂交(FISH)过程中寡核苷酸的确定与应用，本发明还涉及利用本发明提供的寡核苷酸探针对大麦开展非变性荧光原位杂交(ND-FISH)反应体系的建立与对大麦染色体组鉴定的应用。

背景技术：

高等生物染色体复结构杂，在不同染色体区域存在大量的重复序列，基于这一特性，在分子细胞遗传学领域通常通过标记重复序列用于鉴定染色体。其是通过对重复序列进行荧光标记标记制备探针，使用染色体原位杂交方法分析染色体上探针信号的分布状态，从而区分基因组与染色体组。此外，通过比较染色体上探针信号的变化亦是分析染色体行为的普遍做法。进一步地，染色体原位杂交方法在染色体工程育种中也起着至关重要的作用，染色体原位杂交方法是鉴定、区分特定物种基因组与染色体组最有效、直接的方法之一。

目前，已经报道的大麦亚端粒探针仅有Hv01，其是通过扩增大麦基因组亚端粒重复序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通过标记扩增目标序列流程复杂，耗时费力，且受多种因素影响使得标记效果往往不理想。尤其是在进行大量试验操作时，这一方法将在很大程度上影响试验进程与效果。同时，通过标记扩增目标序列开展染色体原位杂交实验的方法需要对目标材料染色体进行变性处理，不仅增加了试验流程，同时在处理过程中易对载玻片上的染色体位置产生位移。当前，ND-FISH技术逐步兴起，替代传统的FISH试验方法。其可通过设计合适的寡合苷酸探针，在不变性的条件下直接对目标材料染色体进行标记，极大地精简了实验步骤、缩短了试验时间，同时保证了试验效果。因此，提供一条能稳定标记大麦亚端粒区域的核苷酸探针将有助于解决当前原位杂交试验中标记大麦亚端粒区域所面临的困境。

技术实现要素：

为克服现有技术上的不足，本发明提供一种能稳定标记大麦染色体组的寡核苷酸探针以及该探针结合其他寡核苷酸探针通过ND-FISH方法鉴定大麦染色体组的应用。

基于以上目的，本发明根据Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)对大麦染色体亚端粒区的研究结果确定引物：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用该引物对栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027全基因组DNA进行PCR扩增反应，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现其产物存在如图1所示的4条较亮条带。选取其250bp左右条带回收并构建质粒进行测序，结果显示，其序列长度为113-116bp，说明所回收的核苷酸中存在两个前后相连的相似性极高的片段。利用NCBI数据库对测序结果Baudin 1进行序列比对分析，检测出其在一段全长为105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登录号为AC256248.1)上存在64个拷贝。将HV_Mba442-A01分成小片段后反复在NCBI数据库中与其自身比对，最终确定一段相对保守的全长为55bp的核苷酸用于探针制备，其碱基序列为：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，命名为Oligo-442A01，合成该序列并对其进行荧光标记用于制备探针。本发明提供了上述寡核苷酸探针在ND-FISH方法中对大麦染色体标记方法及染色体组鉴定的应用。

本发明的寡核苷酸探针可用于检测大麦材料染色体。

本发明提供了上述寡核苷酸探针在ND-FISH方法中对大麦染色体组鉴定的应用，是用上述寡核苷酸探针与寡核苷酸探针(AGG)₅组成的探针组合对大麦染色体开展ND-FISH试验，综合大麦染色体组的两种探针信号位点分布状况，若在荧光显微镜下能将大麦染色体组区分开，说明寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)₅的组合能用于鉴定大麦染色体组。

本发明提供了检测大麦材料染色体的寡核苷酸探针，即Oligo-442A01，探针核苷酸序列为：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’。(SEQ ID NO.3)

进一步地，提供了Oligo-442A01在检测大麦材料染色体的方法。

本发明提供了Oligo-442A01探针在ND-FISH方法中的应用。

本发明提供了Oligo-442A01探针在大麦种质资源改良中的应用。

本发明提供了Oligo-442A01探针结合(AGG)₅探针在ND-FISH方法中鉴定大麦材料染色体组的应用。

本发明提供了一种寡核苷酸探针Oligo-442A01在ND-FISH方法中检测大麦材料染色体的方法，用寡核苷酸探针Oligo-442A01对大麦材料染色体开展ND-FISH试验，若在荧光显微镜下大麦部分区域表现出对应的信号，说明寡核苷酸探针Oligo-442A01能用于ND-FISH方法中检测大麦材料染色体亚端粒区域。

其中，所述ND-FISH方法反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，滴加10μl(0.35μl1OD/ml Oligo-442A01探针与9.65μl杂交液)混合杂交液，盖盖玻片，置于潮湿的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC缓冲液清洗杂交液两次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，盖盖玻片，于OLYMPUS BX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUS DP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

本发明提供了上述方法在大麦细胞学检测中的应用。

本发明提供了一种寡核苷酸探针Oligo-442A01与寡核苷酸探针(AGG)₅组合在ND-FISH方法中鉴定大麦材料染色体组的应用，用寡核苷酸探针Oligo-442A01与寡核苷酸探针(AGG)₅按一定比例浓度组合对大麦材料染色体开展ND-FISH试验，综合大麦染色体组的两种探针信号位点分布状况，若在荧光显微镜下能将大麦染色体组区分开，说明寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)₅的组合能用于鉴定大麦染色体组。

其中，所述ND-FISH方法反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，滴加10ul(0.35μl 1OD/ml Oligo-442A01探针、0.35μl 1OD/ml(AGG)₅探针与9.30μl杂交液)混合杂交液，盖盖玻片，置于潮湿的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC缓冲液清洗杂交液两次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，盖盖玻片，于OLYMPUS BX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUS DP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

本发明所开发的ND-FISH方法中对大麦染色体进行标记的寡核苷酸探针，直接对大麦染色体进行检测，结果显示该探针能显著地标记于大麦染色体亚端粒区域。该方法不仅具有灵敏度高、检测效果较好的特点，同时还克服了传统的质粒标记方法所带来的流程复杂、标记效果受干扰较大的不足，是一种很好的检测大麦染色体亚端粒区域的寡核苷酸探针。同时，本发明提供的ND-FISH方法鉴定大麦染色体组的应用具有耗时短、灵敏度好、检测效果好、染色体组易于区分的特点，是一种较优的鉴定大麦染色体组的方法。利用本发明提供的寡核苷酸探针及鉴定方法，将使后续研究操作更便捷有效。

附图说明

图1为栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027PCR扩增凝胶电泳检测图，从左到右依次为Marker、Baudin、CN4027。图中从100bp-500bp间存在4条较亮条带，250bp左右条带为回收条带。

图2为栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027扩增序列对比结果。各材料从涂板中选取24株长势较好菌落涂板，再从涂板中挑选3条菌落条带测序，Baudin1、Baudin9、Baudin21分别表示材料Baudin第1、9、21条菌落条带，CN4027 11、CN4027 17、CN4027 19分别表示材料CN4027第11、17、19条菌落条带。

图3为寡核苷酸探针Oligo-442A01在ND-FISH体系中对栽培大麦Baudin(左)、野生大麦CN4027(右)染色体的标记效果图，其中灰色区域为DAPI标记的大麦染色体，亚端粒高亮区域为Oligo-442A01信号点。

图4为寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)₅在ND-FISH体系中对栽培大麦Baudin(左)、野生大麦CN4027(右)开展原位杂交后染色体的信号分布图。其中亚端粒高亮区域为Oligo-442A01信号点，近着丝粒高亮区域为(AGG)₅信号点。从图中可发现，寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)₅信号组合在大麦材料各染色体组上的信号分布存在显著差异，且在两个亲缘关系相对较远的大麦材料中的同一染色体组信号分布位点相似。说明寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)₅的组合能有效地区分大麦染色体组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所使用的大麦材料：栽培品种Baudin、野生品种CN4027，均来自四川农业大学资源学院。本发明所使用生化试剂均为市售。本发明各试剂及配方如下：

DNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit(TaKaRa)。PCR扩增试剂盒：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(TaKaRa)。cDNA回收试剂盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa)。质粒：pMD^TM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)。感受态细胞：Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells(TaKaRa)。琼脂糖凝胶：采用0.5％琼脂糖凝胶检验gDNA，2.0％琼脂糖凝胶检验cDNA。其具体配方如表1。

表1

LB培养基(pH 7.0)：1％(W/V)tryptone,0.5％(W/V)Yeast Extract,1％(W/V)NaCl。

2×SSC缓冲液：0.3M NaCl,0.03M柠檬酸钠。

70％甲酰胺变性剂：70％甲酰胺，溶于2×SSC缓冲液中。

杂交液：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

实施例1 大麦亚端粒重复序列分析及寡核苷酸探针序列的确定

1、大麦基因组DNA的提取

选取待测材料Baudin、CN4027幼嫩叶片，采用柱式法(TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit)提取DNA，提取步骤如下：

a)取150mg新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉迅速加入500μl的Buffer HS I和10μl的50×DTT Buffer混匀，然后加入10μl的RNase A(10mg/ml)，充分振荡混匀，于56℃水浴中温育10分钟。

b)加入62.5μl的Buffer KAC，充分混匀。冰上放置5分钟，12,000rpm离心5分钟。取上清，加入与上清液等体积的BufferGB，充分混匀。

c)将Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中。将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

d)将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

e)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。

f)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入预热至65℃的40μl Elution Buffer，室温静置5分钟。

g)12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。

h)0.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

2、PCR扩增

根据文献(Schubert I,Shi F,Fuchs J,et al.An efficient screening for terminal deletions and translocations of barley chromosomes added to common wheat.The Plant Journal,1998,14:494.)对大麦染色体亚端粒标记探针的研究结果，参考其公布的引物HvT01，其核苷酸序列如下：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)；

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)。利用该引物对Baudin、CN4027进行PCR扩增反应。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

扩增结果如图1。

3、寡核苷酸探针核苷酸序列的确定与探针制备

图1中存在4条明显条带，选择250bp左右条带回收，构建质粒后送样测序，结果如图2。测序结果显示碱基序列为113-116bp长，说明图1中存在的间断条带极有可能为连续相接的重复序列。将B1序列导入NCBI数据库中进行序列比对分析，检测出其在一段全长为105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登录号为AC256248.1)上存在64个拷贝。将HV_Mba442-A01分成小片段后反复在NCBI数据库中与其自身比对，最终确定一段相对保守的全长为55bp的核苷酸用于探针制备，其在HV_Mba442-A01中存在75个拷贝，碱基序列为：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，将其命名为Oligo-442A01，合成该序列并对其进行及荧光标记物质标记用于制作探针。

预期本发明的寡核苷酸探针可便捷快速地用于鉴定大麦染色体亚端粒区域。

实施例2 寡核苷酸探针Oligo-442A01在ND-FISH方法中对大麦染色体标记的方法

1、大麦根尖细胞染色体制片

选取发芽后根长1-2cm根尖于N₂O中处理4h，醋酸灭活，ddH₂O洗净，切取分生区于37℃酶混合液(纤维素酶：果胶酶＝1:1)中酶解37min，吸除酶液后依次用ddH₂O、无水乙醇各洗2次。每1根尖加入20μl乙酸充分搅拌至细胞呈现悬浮状，于每张载玻片上滴10μl悬浮液。光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，并做好标记4℃冰箱中保存备用。

2、染色体原位杂交

取出载玻片自然晾干，混合杂交液按每张载玻片0.35μl 1OD·ml^-1Oligo-442A01与9.65μl杂交液的比例配置，用移液枪将混合杂交液反复打匀，吸取10μl混合杂交液滴于干燥的载玻片上，盖盖玻片于湿润暗盒中37℃孵育2h。取出后避光条件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每张载玻片滴加10μl DAPI，盖盖玻片于OLYMPUS BX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUS DP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

结果如图3，大麦各染色体亚端粒区域均存在显著的信号点，表明本发明开发的寡核苷酸探针Oligo-442A01在ND-FISH试验中对大麦亚端粒区域具有显著地标记效果，能够快捷、准确地用于检测大麦染色体亚端粒区域。

实施例3 寡核苷酸探针Oligo-442A01与(AGG)₅在ND-FISH方法中对大麦染色体组鉴定方法的建立及应用

选取实施例2中制好的载玻片自然晾干，混合杂交液按每张载玻片0.35μl 1OD·ml^-1 Oligo-442A01、0.35μl 1OD·ml^-1(AGG)₅与9.30μl杂交液的比例配置，用移液枪将混合杂交液反复打匀，吸取10μl混合杂交液滴于干燥的载玻片上，盖盖玻片于湿润暗盒中37℃孵育2h。取出后避光条件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每张载玻片滴加10μl DAPI，盖盖玻片于OLYMPUS BX63荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUS DP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠。

检测结果见图4，由图可看出，本发明提供的寡核苷酸探针Oligo-442A01结合(AGG)₅的探针组合能有效识别大麦染色体组。图中亚端粒区域高亮区为寡核苷酸探针Oligo-442A01信号，近着丝粒区域高亮区为寡核苷酸探针(AGG)₅信号。其特点为：1H染色体短小，长臂与短臂Oligo-442A01信号较强，(AGG)₅信号分布于着丝粒附近，且其信号强度较弱；2H染色体短臂存在明显的Oligo-442A01信号，而长臂上不存在Oligo-442A01信号，(AGG)₅信号分布于着丝粒附近，且其信号强度较弱；3H染色体长臂Oligo-442A01信号较强，(AGG)₅信号分布于着丝粒附近，且其信号强度较强；4H染色体长臂与短臂Oligo-442A01信号较强，(AGG)₅信号分布范围较广，主要位于着丝粒附近与短臂区域，且其信号强度在所有染色体组中是最强的；5H染色体短臂存在明显的Oligo-442A01信号，(AGG)₅信号分布于着丝粒附近；6H染色体长臂与短臂Oligo-442A01信号较强，(AGG)₅信号分布于着丝粒附近，其信号强度较适中；7H染色体长臂与短臂均存在Oligo-442A01信号，但其信号强度最弱，(AGG)₅信号集中于着丝粒附近，其信号强度适中。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法

<130> KHP171110047.2TQ

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaaactcgc attttggcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagttcccg taaccggccc 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 大麦

<400> 3

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