长链非编码rna afap1-as1的原位杂交探针、试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂 交探针、检测试剂及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研宄成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序 列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中 IncRNA序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA 不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动 不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研宄领域新的前沿 与热点。
[0003] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱馆（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。
[0004] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研 宄表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽 癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用IncRNA芯片，构建了鼻咽 癌活检组织及正常对照样品中IncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的 IncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达水平与鼻咽癌的淋巴 结转移及临床分期密切相关，针对该IncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的辅助诊断。 随后，我们进一步增加样本，在112例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位 杂交（in situ hybridization)的方法检测了 AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表 达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表达低的患者，因此针对该IncRNA 的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。
[0005] 我们通过设计并合成革E向AFAP1-AS1的短发夹RNA (short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和 裸鼠转移瘤体内模型中均证实靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭 与转移能力。将AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳 米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸 酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用 方法，利用长链非编码RNA AFAP1-AS1序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的 制剂。
[0007] LncRNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂， 该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。
[0009] 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸 探针，序列如下：
[0010] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' 如 SEQ N0:2 所示，
[0011] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3' 如 SEQ N0:3 所示，
[0012] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3' 如 SEQ N0:4 所示。
[0013] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0014] 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0015] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0016] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0017] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'，
[0018] 阳性对照探针（检测看豕基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，如 SEQ NO: 5 所示，
[0020] GAPDH 探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，如 SEQ NO: 6 所示，
[0021] GAPDH 探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，如 SEQ NO: 7 所示。
[0022] 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、DAB染色试剂；
[0023] 其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子甲酰胺（Deionized Formamide)， 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母转运 RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓罕氏缓冲液（Denhardts' s solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白（BSA)，三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻断试剂（Blocking reagent agent)，TNB 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻断试剂），TNT 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0024] 我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现AFAP1-AS1 在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达与预后密切相关，AFAP1-AS1表达高的患者 生存时间更短，提示AFAP1-AS1可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅 助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应 用前景。
【附图说明】
[0025] 图1为实时荧光定量PCR技术验证IncRNA AFAP1-AS1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮 中的表达情况；
[0026] AFAP1-AS1在鼻咽癌（NPC)中的表达比正常鼻咽上皮（Normal)中显著提高，且与 淋巴结转移（左）及临床分期（右）密切相关，AFAP1-AS1的表达在有淋巴结转移的鼻咽 癌组织（NPC_Nl/2)中比没有淋巴结转移（NPC_N0)的更高（左图），AFAP1-AS1的表达也随 鼻咽癌患者临床分期逐渐增高（右图，I、II、III分别代表临床I、II、III期）。
[0027] 图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0028] 正常鼻咽上皮（NPE)中表达水平较低（仅在2例正常鼻咽上皮组织中检测到有低 表达，其余8例中检测不到表达），而在69. 64%的鼻咽癌（112例鼻咽癌组织中的78例） 中检测到有AFAP1-AS1的表达，其中55例为低表达（NPC_Low)，23例为高表达（NPC_High)， 其余的34例鼻咽癌组织中未检测到AFAP1-AS1的表达（NPC_negative) ;P〈0. 001。
[0029] 图3为鼻咽癌中AFAP1-AS1的表达与鼻咽癌患者预后的关系
[0030] 鼻咽癌中AFAP1-AS1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即AFAP1-AS1高 表达的患者总的生存时间（Over-all survival，左）和无复发生存时间（Relapse-free sruvival，右）要明显低于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者。
[0031] 图4为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体，可显著抑制AFAP1-AS1在鼻 咽癌细胞中的表达
[0032] 在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中导入靶向AFAP1-AS1的干扰载体（sh-1， sh-2, sh-3)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表达情况， AFAP1-AS1的表达均受到明显的抑制。阴性对照（NC)为scramble干扰载体，Mock为未经 任何处理的鼻咽癌细胞。
[0033] 图5为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 侵袭能力降低
[0034] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低。
[0035] 图6为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 迀移能力降低
[0036] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移速度明显减 慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低。
[0037] 图7.动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力
[0038] 在鼻咽癌细胞5-8F中转入shRNA干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，经尾静脉 将鼻咽癌细胞注射到裸鼠体内，观察肺转移情况，发现与对照组（NC)相比，shRNA敲低 AFAP1-AS1表达的5-8F细胞肺转移灶的数目变少（图7A-C，P〈0. 05)，转移灶的体积变小 (图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【具体实施方式】
[0039] 以下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0040] 实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实AFAP1-AS1在鼻咽癌中表达上调
[0041] 1.材料与方法：
[0042] 收集10例正常鼻咽上皮组织和31例鼻咽癌组织，抽提总RNA，2 μ g RNA经逆转录 成cDNA后，进行实