PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用 group t-test 检验计 算P值。
[0169] 2.结果
[0170] 这三个shRNA载体转染鼻咽癌细胞5-8F、HKl和HNE2后，均可显著下调鼻咽癌细 胞中AFAP1-AS1的表达水平（图4)。
[0171] 实施例4,制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表 达
[0172] L材料方法
[0173] I. 1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒
[0174] 多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OPlO/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行 娃纳米颗粒（silica nanoparticle, SiNP)的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和通过离 子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得 到：
[0175] 1)将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯（TEOS)，继续搅 拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80°C干 燥，研细得硅纳米颗粒（SiNP)。其中H 2O与0P-10及H2O与TEOS的摩尔比为2~10、氨水 浓度为1. 6~28%、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L。
[0176] 2)将SiNP按(λ 1~10mg/ml重悬于(λ 6M似0)3溶液中，超声分散，离心，弃上清， 再将沉淀物按0. 1~l〇mg/ml重悬于PBS (pH 7. 4)中，超声分散，加多聚赖氨酸（终浓度 为4~15nmol/mL)，充分混勾，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖 氨酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4~15nmol/mL。
[0177] 3)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5~30:1与实施例3中所述的靶向 AFAP1-AS1的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。
[0178] 1.2细胞培养与转染
[0179] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F、HK2和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于6 孔板中，将6孔板置于37 °C，5 % 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70 %密度即可开始 AFAP1-AS1真核表达载体的转染；转染过程如下：
[0180] 在无菌EP管中加入100 μ 1制备好的携带AFAP1-AS1真核表达质粒的多聚赖氨酸 修饰的硅纳米颗粒悬液，与100 μ 1无血清培养基温和混匀；用D-Hank' s液洗涤细胞3次； 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的1个 孔；将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过 夜。用携带Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒作为实验对照。
[0181] 1.3细胞穿膜实验
[0182] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8 μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国BD公司，4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液 (0· 1 % g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水 化。
[0183] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和I X IO5个转染了 AFAPl-ASlshRNA干扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞，在Transwell小室下层加 入含20%胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醛固定液固定，结晶 紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迀移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的 鼻咽癌细胞。
[0184] 1.4细胞划痕实验
[0185] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迀移能力的实验方法。转染了 AFAP1-AS1 shRNA 干扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%时，用 200ul pipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各 个时间点（视不同细胞迀移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细 胞迀移速度。
[0186] 2.结果
[0187] 2. 1在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1后，细胞侵袭能力 降低
[0188] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低（图5)。
[0189] 2. 2在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞迀移 能力降低
[0190] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减慢， 划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低（图6)。
[0191] 实施例5,裸鼠转移瘤模型证实抑制AFAP1-AS1的表达可以抑制鼻咽癌细胞的转 移能力
[0192] 1.材料与方法
[0193] 16只雄性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19±2g，购买于上海斯莱克实验动物有限 公司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学实验动物部于无特定病原体（SPF)条件下饲养。 AFAP1-AS1干扰载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、细胞培养与转染等同实 施例4。转染AFAP1-AS1干扰载体或scramble载体（NC)的5-8F细胞各取I X IO6个，经尾 静脉注入裸鼠体内（8只每组），10周后处死裸鼠，观察鼻咽癌细胞的转移情况（主要转移 到裸鼠肺中）。
[0194] 2.结果
[0195] 动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力（图 7)。与对照组（NC)相比，敲低AFAP1-AS1的5-8F细胞肺转移灶的数目（图7A-C，P〈0. 05) 变少，转移灶的体积变小（图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【主权项】
1.长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或 者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预 测的制剂为原位杂交检测试剂。3. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针， 序列如下： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'。4. 根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中含有用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'， 试剂盒中还含有阳性对照探针， GAPDH探针I :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3, 〇6. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。7. 用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针，序列 如下： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'。8. 用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，是包含有权利要求7所述 的寡核苷酸探针的试剂盒。9. 根据权利要求8所述的原位杂交检测试剂，其特征在于，试剂盒中还含有阳性对照 探针： GAPDH探针I :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3, 〇10.根据权利要求8或9所述的原位杂交检测试剂，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用。该长链非编码RNA可以用于制备鼻咽癌患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证实AFAP1-AS1在鼻咽癌组织中表达上调，高表达AFAP1-AS1的鼻咽癌患者比低表达AFAP1-AS1的鼻咽癌患者预后差，因此，将AFAP1-AS1的表达用于鼻咽癌患者的预后预测，可以为鼻咽癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/11
【公开号】CN104894128
【申请号】CN201510239144
【发明人】曾朝阳, 孛昊, 李桂源, 熊炜, 李小玲, 李夏雨, 龚朝建, 曾勇, 张文玲, 石磊, 连瑜, 荆益州
【申请人】中南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日