专利名称：一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其是一种EAAT2基因 cRNA原位杂交的探针及其设计方法。
背景技术：
谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的神经递质，在体内主要与亲离子性和亲代谢性两种谷氨酸受体家族结合发挥活化作用。谷氨酸如果在细胞外浓度过高，过度兴奋谷氨酸受体可导致神经细胞死亡，由于细胞外没有能分解谷氨酸的酶，释放的谷氨酸几乎完全依赖神经元以及神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运蛋白(EAAT)的摄取来保持浓度的相对稳定，同时EAAT也为体内很多代谢途径提供谷氨酸来源。谷氨酸转运蛋白分高亲合力和低亲合力转运蛋白两种，高亲合力转运蛋白都作用于依赖钠-钾的L-谷氨酸，L-和 D-天冬氨酸，所以也称为钠-钾谷氨酸转运蛋白或兴奋性氨基酸转运蛋白(Excitatory amino acid transporter, EAAT)。目前已有五种被克隆，它们是 EAATl (GLAST， Glutamate-aspartate transporter), EAAT2(GLT, glial glutamate transporter), EAAT3(EAAC, excitatory amino acid Carrier), EAAT4 和 EAAT5。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。本发明的目的是通过以下技术方案来解决的一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCG TTATCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCAT TGCCATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAG TTAGTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAG GACTT 3'。所述探针的设计方法(I)根据EAAT2的Gene bank序列我们设计了 EAAT2特异的引物，并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列；(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；⑶EAAT2的cRNA原位杂交探针； (4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。所述步骤⑴中EAAT2特异的引物是上游引物是5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3'；下游引物是5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。所述步骤(2)按照如下步骤进行
(a)将大鼠的cDNA用设计的弓丨物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接;(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。所述步骤(3)按照如下步骤进行(a)步骤⑵得到的细菌测序正确后，经判断确认EAAT2探针序列插入载体的顺序是正向的；(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。所述步骤(4)按照如下步骤进行(a)将大鼠用O. 4戍巴比妥纳深麻后，经左心室插管至升王动脉，用O. Olmol/ L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4 %多聚甲醛灌注固定；所述的O. 01mol/L DEPC-PBS是2. 9克磷酸氢二钠，O. 29克磷酸二氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为O. 1%的DEPC Iml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4% 的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500. Oml 的O. 2mol/L PB缓冲液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB缓冲液是用29. 01克磷酸氢二钠， 2. 96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成；(b)取材后进行脑组织的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存于O. 01mol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用；(d)将切好的组织片用O. 01mol/L的DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5-10分钟；(e)将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次，室温，每次5_10分钟；所述5x SSC 是由20x SSC用超纯水稀释的，20x SSC为一种柠檬酸缓冲液；(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育1_2小时； 所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2. 5ml的20x SSC溶液，200μ I的50x Denhardt’s 溶液，50 μ I的浓度为200mg/ml的Heparin溶液，100 μ I的浓度为10mg/ml的tRNA溶液， 100 μ I的浓度为10%的CHAPS溶液，100 μ I的浓度为10 %的Tween-20溶液，100 μ I的浓度为0. 5mol/L的pH8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50x DenhardtJ s为一种常用的杂交试剂；所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA为IOmg的tRNA粉末溶于Iml的 DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS为Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的Tween-20为100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成；所述0. 5mol/L的pH8. O的EDTA为186. Ig 二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H20中在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8. O然后定容至IL配制而成高压灭菌备用； 所述DEPC-H2O为IL超纯水加入体积百分比为0. 1%的DEPC 1ml，放置过夜并高压灭菌处理后的水；(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为I. Oug/ml的cRNA探针配置成的；(h)杂交后用Ix SSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；⑴用2x SSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10-15分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37。。，I 次，每次 30-40 分钟；(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；(I)用0. Olmol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；所述
0.01mol/L PBS是2. 9克磷酸氢二钠，0. 29克磷酸二氢钠，9. 0克氯化钠用超纯水定容至IL 配置的磷酸缓冲液；(m)按I : 2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；(n)将经过上步抗体孵育的组织片用0. 01mol/L PBS洗涤，于室温，清洗3次，每次 10-15分钟；(O)用TS9. 5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15-20分钟；所述TS9. 5为是由终浓度为摩尔浓度为0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩尔浓度为0. lmol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/LMgCL2用超纯水配制而成；(p)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4 6小时，在此过程中观察切片呈色强度；所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液；(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10-15分钟；(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上；(S)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。本发明的有益效果是本发明对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中EAAT2基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中EAAT2基因mRNA水平的变化。本发明使用的EAAT2的探针序列，对EAAT2基因mRNA的显示有明确的特异性，实现了对EAAT2基因mRNA水平的显示作用。
图I为本发明的EAAT2在海马的分布X4倍图；图2为本发明的EAAT2在海马的分布X20倍图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步详细描述参见图I和图2，EAAT2基因cRNA原位杂交的探针的设计方法，按照如下步骤(I)根据EAAT2的Gene bank序列我们设计了 EAAT2特异的引物，并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列；(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；⑶EAAT2的cRNA原位杂交探针；(4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。探针的设计
根据EAAT2的Gene bank序列我们设计了 EAAT2特异的引物，并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列。EAAT2特异的引物如下上游引物5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3'；下游引物5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。EAAT2特异的探针序列5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCG TTATCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCAT TGCCATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAG TTAGTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAG GACTT 3' EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒的构建I.将大鼠的cDNA用设计的弓I物进行PCR扩增。2.将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收。3.将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接。4.将连接好的质粒转化细菌后，摇菌培养送金斯瑞公司进行测序。EAAT2的cRNA原位杂交探针的制备I.测序正确后，经判断确认EAAT2探针序列插入载体的顺序是正向的。2.需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切，3.将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收。4.用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记，体外转录的试剂盒(Ambion MEGAscript)是Ambion公司的产品。 EAAT2的cRNA探针的原位杂交检测I.将大鼠用O. 4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用O. Olmol/L的 DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。2.取材后进行脑组织的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时。3.将固定好的组织进行切片将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存于O. Olmol/L DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用。4.将切好的组织片用O. Olmol/L DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5分钟。5.将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次，室温，每次5分钟。6.将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育I小时。7.将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时。8.杂交后用Ix SSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟。9.用2x SSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10分钟。10.用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C，I 次，每次 30 分钟。11.用2x SSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟。12.用0. 01mol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟。13.加入抗体Anti-Digoxigenin-AP对洗涤后的组织切片进行孵育，于室温，放置过夜。14.将经过上步抗体孵育的组织片用O.Olmol/L PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10分钟。15.用TS9. 5洗涤上述O. 01mol/L PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15分钟。16.将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4 6小时，在此过程中观察切
片呈色强度。17.当呈色完成后，将切片用0. 01mol/L PBS清洗3次，室温，每次10分钟。18.将上述洗涤后切片表于载玻片上。19.晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。所用试剂
TIANGEN胶回收试剂盒公司:天根货号DP214-02
两端具有T7，SP6启动子的载体公司invitrogen货号K466001
BamH I限制性内切酶公司Takara货号D1010A
SP6 RNA聚合酶试剂盒公司Ambion货号ΑΜ1330
20x SSC公司invitrogen货号ΑΜ9763
50x Denhardt’ s公司invitrogen货号750018
Heperine公司sigma货号Η3393
tRNA公司sigma货号R8759
CHAPS公司sigma货号C9426
Tween-20公司sigma货号Ρ9416
Anti-Digoxigenin-AP公司Roche货号:11093274910
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽
然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针，其特征在于，该探针的序列为5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCGTTA TCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCATTGC CATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAGTTA GTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAGGACT T 3'。
2.如权利要求I所述探针的设计方法，其特征在于(1)根据EAAT2的Genebank序列我们设计了 EAAT2特异的引物，并且此对引物扩增出 278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列；(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)EAAT2的cRNA原位杂交探针；(4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。
3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(I)中EAAT2特异的引物是上游引物是 5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3'；下游引物是 5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。
4.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接；(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。
5.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行(a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认EAAT2探针序列插入载体的顺序是正向的；(b)需要使用BamHI限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。
6.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行(a)将大鼠用O.4%戍巴比妥纳深麻后，经左心室插管至升王动脉，用O. 01mol/L的 DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的O. 01mol/L DEPC-PBS 是2. 9克磷酸氢二钠，O. 29克磷酸二氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为O. I %的DEPC Iml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4%的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500. Oml的 O. 2mol/L PB缓冲液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB缓冲液是用29. 01克磷酸氢二钠， 2. 96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成；(b)取材后进行脑组织的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片将组织切成25 30μ m组织切片，并将切好的切片保存于O. 01mol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用；(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5_10分钟；(e)将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5-10分钟；所述5x SSC是由 20x SSC用超纯水稀释的，20x SSC为一种柠檬酸缓冲液；(f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育1-2小时；所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2. 5ml的20x SSC溶液,200 μ I的50x DenhardtJ s 溶液，50 μ I的浓度为200mg/ml的Heparin溶液，100 μ I的浓度为10mg/ml的tRNA溶液， 100 μ I的浓度为10 %的CHAPS溶液，100 μ I的浓度为10 %的Tween-20溶液，100 μ I的浓度为O. 5mol/L的pH8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50x DenhardtJ s为一种常用的杂交试剂；所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA为IOmg的tRNA粉末溶于Iml的 DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS为Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的Tween-20为100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成；所述O. 5mol/L的pH8. O的EDTA为186. Ig 二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H20中在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8. O然后定容至IL配制而成高压灭菌备用； 所述DEPC-H2O为IL超纯水加入体积百分比为O. 1%的DEPC 1ml，放置过夜并高压灭菌处理后的水；(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时； 所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为I. Oug/ml的cRNA探针配置成的；(h)杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；(i)用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10-15分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C，I 次，每次 30-40 分钟；(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；(I)用O. Olmol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；所述O. 01mol/L PBS是2. 9克磷酸氢二钠，0. 29克磷酸二氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL配置的磷酸缓冲液；(m)按I : 2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗漆后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；(η)将经过上步抗体孵育的组织片用0. Olmol/L PBS洗涤，于室温，清洗3次，每次 10-15分钟；(ο)用TS9. 5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15-20分钟；所述 TS9. 5为是由终浓度为摩尔浓度为0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩尔浓度为0. lmol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/LMgCL2用超纯水配制而成；(P)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4 6小时，在此过程中观察切片呈色强度；所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液；(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10-15分钟；(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上；(S)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。
全文摘要
本发明公开了一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法，按照如下步骤(1)根据EAAT2的Gene bank序列我们设计EAAT2特异的引物，并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列；(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备EAAT2的cRNA原位杂交探针；(4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。
文档编号C12N15/11GK102605051SQ20121002202
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者李俊杰, 李霄, 窦科峰, 赵威 申请人:中国人民解放军第四军医大学