沙门氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域，具体涉及一种SAL夹心DNA杂交技术快速检测用探针、 试剂及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌（SahofleWa，SAL)是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。 沙门氏菌中最早被发现的是猪霍乱沙门氏菌。沙门氏菌主要为动物致病菌，但也可通过污 染食品或水源等途径感染人类，成为人类的条件致病菌，如鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏 菌、猪霍乱沙门氏菌等。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死 疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。由于沙门氏菌的分布广，如果 畜禽粪便污染了食品加工场所的环境或用具，就会造成食品在加工、运输、贮存、销售及动 物屠宰等环节受到沙门氏菌的污染。一旦条件适宜，沙门氏菌就会迅速的生长繁殖，当菌数 在食品中达到一定数量，被消费者食用后就会造成食物中毒，危害人的身体健康，甚至危及 生命。
[0003] 据统计，在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜 首；而我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有2500 个以上血清型。因此，沙门氏菌的检测一直是沙门氏菌研究的核心问题。蛋、家禽和肉类 产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状 况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污 染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病，因此， 建立一种快速，大批量的沙门氏菌检测方法尤为重要。国内外利用夹心DNA杂交方法对食 品中微生物的检测已有一些报告，但对动物制品中SAL检测方法的报导还很少。
[0004] 夹心 DNA 杂交技术（sandwich DNA hybridization assay,简称 DNAH)是 2007 年 美国NE0GEN公司开发的一种核酸分子杂交技术，根据病原菌核糖体RNA (rRNA)特性，设计 分别含有目标病原菌rRNA特异性的捕获探针和检测探针两种探针，在捕获探针3'端标记 poly dA将靶标核酸片段锚定在包被了 poly dT的96孔板微孔中，在检测探针5'端标记辣 根过氧化物酶进行显色反应，两种探针与目标病原菌rRNA的特异性结合，能确保检测结果 的准确性。检测过程可在2 h内完成，最后结果判断可通过观察颜色变化并进行0D值的测 定。与现有检测方法相比，夹心DNA杂交技术基于自发性的DNA杂交反应，两条探针共同捕 获目标病原菌，极大地降低了假阳性和假阴性率，结果准确，最大程度地降低样品基质对分 析结果的影响。
[0005] 目前国内尚无利用夹心DNA杂交技术检测SAL的试剂盒。
【发明内容】
[0006] 为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种沙门氏菌夹心DNA杂交 技术快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供使用上 述检测用探针的试剂盒的使用方法。
[0007] 为了实现上述第一个目的本发明采用如下技术方案：沙门氏菌夹心DNA杂交快速 检测用探针，包括SAL捕获探针和SAL检测探针，其中SAL捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO. 1，SAL检测探针的DNA序列为SEQ ID NO. 2。
[0008] 为了实现上述第一个目的本发明提供一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用试 剂盒，其特征在于：包括包被了 poly dT的96孔板、菌液溶解液、溶解缓冲液、核酸杂交液、 探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液，其中一个微孔反应的用量为： 所述探针液由以下成分组成： DNA 序列为 SEQ ID NO. 1 的 4 y mol/L 的 SAL 捕获探针 20. 8 y L ; DNA 序列为 SEQ ID NO. 2 的 4 y mol/L 的 SAL 检测探针 20. 8 y L ; 合计 41. 6 y L。
[0009] 所述溶解液，体积为30 y L (所述两瓶浓的菌液溶解液，为干粉状，每瓶需用6mL溶 解缓冲液溶解；所述溶解缓冲液，体积为12mL); 所述核酸杂交液，体积为83. 4 y L ; 所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为150 y L ; 所述显色液，体积为150 y L ; 所述终止液，体积为100 y L ; 所述阳性对照液，为SAL菌液，体积为5mL ; 所述阴性对照液，为非SAL菌液，体积为5mL。
[0010] 为了实现本法明的第三个目的，本发明提了一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测 方法，包括如下步骤： (1) 增菌 用营养肉汤（NB)扩增待检样品12 h，获得待检样品液； (2) 菌液溶解反应 将待检样品液和溶解液按4 : 1的比例在玻璃管中混合，放入 65 °C水浴锅中培养5分钟。
[0011] (3)杂交反应 吸取150 yL步骤（2)溶解后的菌液加到包被了 poly dT的微孔 中，再按2:1比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125 y L加到每一个含有菌液的微孔中， 在室温下于轨道式摇床上以150 rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用 1 X PBST Buffer洗板5次，加150 y L TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟， 最后加入100 yL 2 M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450 nm处的吸光度。
[0012] (4 )结果判定（菌液0D值-空白对照0D值V (阴性对照0D值-空白对照0D 值）多2. 1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深病原菌浓度越高。
[0013] 本发明的原理是：根据致病菌核糖体RNA (rRNA)特性，设计分别含有目标致病菌 rRNA特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸片段锚定，在检测探 针末端标记辣根过氧化物酶，两种探针与目标致病菌rRNA的特异性结合，确保检测结果的 准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行0D值的测定，检测灵敏度可达到lCFU/25g样 品。
[0014] 夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂 交技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性 和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地 降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减 少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的SAL检测周期较长，约1~2天，操作繁琐， 而本发明的试剂盒仅需2小时。本发明应用夹心DNA杂交探针将核酸分子杂交技术运用于 SAL的快速检测，特异性、准确性比普通PCR方法更高，同时可以免除昂贵的仪器投入，便于 出入境和食品安全病原菌检测的推广应用。
[0015] 本发明的优点是（1)、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为模版； (2)、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌rRNA结合，根据辣根过氧化物酶是否显色 就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99. 9%，假阳性率小于0. 1% ; (3)、快速、高效 扩增：检测时间2小时左右；（4)、灵敏度高：扩增模板仅需1 X 105 CFU/mL或更少，猪肉组织 样品中细菌最低检测极限达到1. 2 CFU/mL ;标本的检出率达到99% ; (5)、鉴定简便：只需通 过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定0D值判定结果，显色液加入微孔后变 为蓝色且(菌液0D值-空白对照0D值)/ (阴性对照0D值-空白对照0D值)彡2. 1即可判 定为阳性（6)、用途广：可广泛用于SAL的安全快速检测。
【附图说明】
[0016] 图1 SAL的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果； 图2 SAL的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果； 图3阴阳性对照夹心DNA杂交扩增结果； 图1中：1.肠炎沙门氏菌，2.鼠伤寒沙门氏菌，3.霍乱沙门氏菌，4.福氏志贺氏菌， 5.大肠杆菌，6.金黄色葡萄球菌，7.单核细胞增生李斯特氏菌，8.副溶血性弧菌。
[0017] 图 2 中：1、1. 2X107 CFU/mL SAL 菌液，2、1. 2X106 CFU/mL SAL 菌液，3、1. 2X105 CFU/mL SAL 菌液，4、1. 2 X 104 CFU/mL SAL 菌液，5、1. 2 X 103 CFU/mL SAL 菌液，6、1. 2 X 102 CFU/mL SAL 菌液，7、1. 2 X 101 CFU/mL SAL 菌液，8、1. 2CFU/mL SAL 菌液。
【具体实施方式】
[0018] 本发明中无特别说明的反应液，均为市售