一种快速检测top2a基因异常的荧光原位杂交探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速FISH探针的设计和应用，特别是快速检测T0P2A基因是否异 常的荧光原位杂交探针。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是妇女中常见的恶性肿瘤之一，在西方国家其发病率和病死率居肿瘤之 首，近年来，，在我国的发病率也呈直线上升的趋势。
[0003] 临床研究表明，T0P2A基因异常的乳腺癌患者的无复发生存期（RFS)缩短，预后 差，尤其是T0P2A基因缺失的乳腺癌患者预后更差。T0P2A基因异常的患者接受蒽环类药 物的化疗方案效果要优于T0P2A基因正常的患者，T0P2A异常的患者使用CEF方案（环 磷酰胺+表阿霉素+氟尿嘧啶，其中表阿霉素为蒽环类药物）进行治疗可降低65%的复发 风险和71 %的死亡风险，而T0P2A正常的患者使用此方案只能降低6%的复发风险和10% 的死亡风险。因此，检测乳腺癌患者中T0P2A的基因状态有助于判断预后以及指导临床合 理用药。
[0004] 目前检测T0P2A基因的方法包括：免疫组织化学法（IHC)检测T0P2A蛋白过表 达、荧光原位杂交法（FISH)检测T0P2A基因拷贝数、酶联免疫吸附试验（ELISA)检测血 清T0P2A E⑶(上皮钙黏附素）或肿瘤组织。其中最实用的方法是FISH。由于传统FISH探 针序列的长度较大，导致所需要的杂交时间很长(一般是过夜杂16-18小时)，不能及时的得 到检测结果，这不利于临床的诊断及治疗。对FISH探针进行改进，缩短杂交时间，提高检测 效率，有利于临床的诊断及治疗。
[0005] 有必要开发出一种快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，包括T0P2A基因特异性探针，17号染色 体特异性探针。
[0008] 1.探针的序列分别为： T0P2A基因特异性探针序列：
17号染色体特异性探针序列：
2.上述探针是对应染色体上为重复性高，特异性好的短序列。
[0009] 3.上述检测试剂盒中的使用的探针中，T0P2A基因特异性探针连接的荧光基团为 绿色荧光基团；17号染色体特异性探针连接的荧光基团为红色荧光基团。
[0010] 4.探针所用缓冲液为：2〇1111~5〇11111^8-此1(?!18.0~8.8)，1〇11111%(31 2，10%~ 30%甲酰胺。
[0011] 5.将探针玻片上的杂交区域置于杂交仪中进行变性杂交，变性温度为95°C，变性 时间为lOmin，杂交温度为42°C，杂交时间为20min。
[0012] 6.结果的判定，杂交完毕，在荧光显微镜下观察，观察50个计数细胞，统计每个 细胞核中的红色信号数量和绿色信号数量并计算比值（比值=50个细胞核中绿色信号 总数/50个细胞核中红色信号总数）。若比值大于2.0,则判定T0P2A基因扩增；若比值小 于〇. 8,则判定T0P2A基因缺失；若比值处于0. 8-2. O之间，则再次观察计数，计数结果仍处 于0. 8-2. O之间的判定为T0P2A基因正常。
[0013] 本发明的有益效果是： 本发明试剂盒，采用优化的短序列荧光探针，将原有的FISH检测时间由16~18小时 缩短至1~2小时，可以快速地检测T0P2A基因状态，有利于更准确地制定后续的治疗方 案。
【附图说明】
[0014] 图1表示的是样本通过处理后，用T0P2A基因特异性探针和17号染色体特异性探 针进行杂交后的镜检结果，如图所示，杂交染色后，细胞核轮廓清楚，细胞核中红色信号和 绿色信号清晰可见，可选择为计数细胞。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 : 一、快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，包括T0P2A基因特异性探针和17 号染色体特异性探针。
[0016] 1.其中，探针的序列分别为： T0P2A基因特异性探针序列：
CN 105177120 A 说明书 3/4 页
2.上述探针是对应染色体上为重复性高，特异性好的短序列。
[0017] 3.上述检测试剂盒中的使用的探针中，T0P2A基因特异性探针连接的荧光基团为 绿色荧光基团；17号染色体特异性探针连接的荧光基团为红色荧光基团。
[0018] 4.探针所用缓冲液为：2〇1111~5〇11111^8-此1(?!18.0~8.8)，1〇11111%(31 2，10%~ 30%甲酰胺。
[0019] 5.将探针玻片上的杂交区域置于杂交仪中进行变性杂交，变性温度为95°C，变性 时间为lOmin，杂交温度为42°C，杂交时间为20min。
[0020] 二、FISH 检测 1. 将石錯包埋样本玻片放入65±5°C恒温箱中烤片过夜； 2. 取出玻片，将其放入室温二甲苯中15分钟，重复一次； 3. 取出玻片，再将其放入室温无水乙醇中10分钟； 4. 取出玻片，再将其依次放入室温100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇各3分钟； 5. 取出玻片，再将其放入室温去离子水中3分钟； 6. 取出玻片，再将其放入95°C -99°C的样本处理液中煮片10分钟(切片水平放置于容 器中，样本面朝上）； 7. 取出玻片，等其凉至室温后，再将其放入无菌纯水中3分钟，用无绒纸巾吸去多余水 分(不能触碰到组织）； 8. 室温晾干，将玻片平摊放在恒温箱或加热平台上，在样本区域滴加适量(覆盖整个样 本区即可）的蛋白酶K反应液，37°消化5~15分钟； 9. 倒去玻面上的多余液体，将其放入室温洗液1中5分钟，重复一次 10. 取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各2分钟，室温晾干 11. 从_20°C冰箱中取出IOnmol/管的探针干粉12000r/min离心5min ;加入IOOul的 缓冲液，震荡混匀。
[0021] 12.在玻片上加10 μ 1的杂交探针到杂交区域，迅速盖上22 X 22mm盖玻片，轻压使 杂交液均匀分布，避免产生气泡； 13. 用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位； 14. 将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置 "Denat&Hyb" 程序，杂交(变性 95°C lOmin，杂交 42°C 20min)。
[0022] 15.将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片(若盖玻片难以去除，可以将其放入 洗液2中微微摇晃，以利于其脱落）； 16. 玻片放入洗液3中室温孵育5分钟； 17. 取出玻片，再将其放入洗液4中室温孵育2分钟； 18. 取出玻片，室温自然干燥玻片； 19. 室温，滴加10 ul DAPI复染剂到22 X 22mm的盖玻片，载玻片目标区域朝下，轻放 于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。
[0023] 注意事项：FISH检测第15-19步需避光操作。
[0024] 三、检测结果： 镜检结果如图1所示。从图中可以看出，本发明的检测试剂盒中所使用的探针，可以与 目的序列稳定的结合并产生荧光信号，检测结果准确可靠，同时大大缩短了 T0P2A基因的 荧光检测时间，利于疾病的早期诊断与治疗。
【主权项】
1. 一种快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，包括T0P2A基因特异性探针，17 号染色体特异性探针，缓冲液和染色液，其中，探针的序列分别为： T0P2A基因特异性探针序列：17号染色体特异性探针序列：〇2. 根据权利要求1所述的快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，其特征在于： T0P2A基因特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团；17号染色体特异性探针连接的荧 光基团为红色荧光基团。3. 根据权利要求1，2所述的快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，其特征在 于：探针是对应染色体上为重复性高，特异性好的短序列。4. 根据权利要求1，2所述的快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，其特征在 于：将T0P2A基因特异性探针与17号染色体特异性探针按照1 :1混合。5. 根据权利要求1所述的快速检测T0P2A基因异常的荧光原位杂交探针，其特征在于： 探针所用缓冲液为：20mM ~50mM Tris-Hcl (PH8. O ~8. 8)，IOmM Mgcl2,10% ~30% 甲酰 胺。6. 根据权利要求1，2,3,4,5所述的快速检测1'(^24基因异常的荧光原位杂交探针， 其特征在于：将探针加到样本玻片上的杂交区域内于杂交仪中进行变性杂交，变性温度为 95°C变性时间为lOmin，杂交温度为42°C杂交时间为20min。
【专利摘要】本发明公开了TOP2A基因和17号染色体特异性探针序列，以及对快速检测的实验步骤进行细致的描述。这种快速检测的方法大大提高了荧光原位杂交检测效率，有利于临床的诊断及治疗。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105177120
【申请号】
【发明人】陈华云, 刘淑园, 陈嘉昌, 丁渭, 肖湘文, 黄爽, 曾烨, 邓金萍, 刘孝礼
【申请人】广州和实生物技术有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月13日