一种新颖的鸽子性别鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种采用基因检测方法鉴定鸽子等鸟类性别的方法，属于生命科学领 域。
[0002] 背景介绍
[0003] 鸽子是一种单态性鸟，无论在幼鸟还是成鸟时期，都很难从外观形态或其他行为 上区分雌雄。鸽子是一夫一妻制，母鸽需要和公鸽配对后才能繁育后代，如果能够在鸽子出 生后不久就准确地进行性别鉴定，则可以大大提高配对成功率，并且及早淘汰不必要的公 鸽，大大增加其经济效益，因此鸽子的性别鉴定具有重要的意义。
[0004] 鸟类的性别是由染色体决定的，其性别决定方式为ZW型，雄鸟有一对Z染色体，而 雌鸟则是一个Z染色体和一个W染色体。这两种染色体上都有一个CHD基因，该基因在Z 染色体和W染色体上的序列具有一定差异，分别称为CHD-Z和CHD-W。由于CHD-Z和CHD-W 基因在非平胸鸟类（现存鸟类中，除了鸵鸟、鸸鹋和几维鸟等走禽以外，其他都属于非平胸 鸟类）中存在且具有同源性，因此可以利用该基因在Z染色体上和W染色体上的差异鉴别 绝大多数的禽类，具有很大的通用性。自1995年开始，CHD基因被广泛应用于鸟类性别的 分子鉴定，CHD基因已经成为非平胸鸟类性别鉴定最重要的分子标记。
[0005] 传统做法采用PCR+凝胶电泳，其中最经典的P2/P8引物鉴定方法设计如下：在 CHD-Z和CHD-W保守区域设计一对引物（P2/P8)，可以同时扩增CHD-Z和CHD-W基因，但扩增 产物大小不同，CHD-Z的扩增片段是450bp，CHD-W的扩增片段是380bp，不同鸟类片段大小 各有差别。由于不论雌鸟还是雄鸟都会有CHD-Z基因，因此是否检测到CHD-Z扩增产物可 以作为扩增反应是否正常进行的参照，避免了将实验失败的结果误判为雄性；而CHD-W基 因是雌性专有的，只有雌性才可能检测到CHD-W扩增。扩增结果可以简单描述为：凝胶电泳 出现ZW两条带的为雌性，只出现Z -条带的为雄性，这种方法的优点是成本较低，在现有鉴 定条件下被广泛地采用，缺点是操作繁琐、时间长，而且容易造成污染【参考文献1】。最近 的研究表明，这两个片段虽然大小不同，但是熔解曲线温度是一样的，无法采用熔解曲线分 析方法来区分。
[0006] 最近几年来，有人开始采用实时荧光PCR+熔解曲线分析的方法，重新设计了引物 和检测方法，利用CHD-W和CHD-Z扩增产物的熔解温度（以下简称Tm值）不同来区分ZW 条带【参考文献2】。但CHD-Z和CHD-W扩增反应是分别在两个PCR反应管中进行的，一是 增加了经济成本，实用性较低；二是可能发生误判，例如，操作者在Z反应管内加入样本，而 W反应管则因疏忽或移液器漏气而未加入样本，则会造成雌性样本误判出雄性结果。
[0007] 最新报道是在一管内用相同的引物扩增CHD-W和CHD-Z，利用扩增片段中Z和W具 有3个SNP，导致的扩增产物的熔解温度（Tm值）不同来进行区分，由于只采用了一对引物， 且所产生的片段序列和大小非常接近，无法用凝胶电泳区分【参考文献3】。这样的设计带来 的问题是：1.没有熔解曲线分析仪的用户无法采用；2.由于无法分成两管单独扩增CHD-Z 和CHD-W片段，缺乏简单有效的方法验证结果。
[0008] 既能够在一管内同时扩增CHD-Z和CHD-W的特异性片段，又可以在两管内单独扩 增CHD-Z和CHD-W的特异性片段来验证结果，既可以用熔解曲线分析，也可以用凝胶电泳将 这两个扩增产物清晰地区分开来的方法，目前还没有报道。这正是本发明所解决的问题。 [0009] 参考文献
[0010] 1.贾晓旭等，利用羽毛对鸽子进行分子性别鉴定[J].农业生物技术学报，2010， 18(5) :1019-1023
[0011] 2. Hurng-ffem Huang 等.High-throughput gender indentification of three Columbidae species using melting curve analysis[J] ；Theriogenology 75(2011)73-79
[0012] 3. Cassandra E. Faux 等，High-throughput real-time PCR and melt curve analysis for sexing Southern Ocean seabirds using fecal samples[J]； Theriogenology 81(2014)870-874
【发明内容】
[0013] 本发明提供了两对特别设计的CHD-Z和CHD-W的特异性引物，用于鸽子的性别鉴 定，也适用于目的片段和鸽子具有同源性的其他非平胸鸟类的性别鉴定。
[0014] 引物序列如序列表中SEQ ID NO :1-4所示。
[0015] PCR引物扩增的是一对引物之间的一整个片段，通过增加或减少本发明所公开的 引物序列的5'和3'端的若干个碱基序列（通常< 10个），也可能扩增出本发明所设计的 目标片段，因此不能通过简单增加或减少本发明所公开的引物序列的若干个碱基序列来规 避本发明的保护范围。
[0016] 本发明提供了一种特别设计的实验方法，CHD-Z和CHD-W基因的特异性片段扩增 可以在同一个PCR反应管中实现，这2个片段之间的Tm值差异达到了 3°C左右，使得这两 个PCR反应在同一个管中进行而彼此可以很好地区分；目标片段的分子量分别为116bp和 83bp，使得这两个扩增片段在同一个凝胶电泳通道中彼此可以很好地区分。
[0017] 本发明提供的实验设计也支持将CHD-Z和CHD-W基因的特异性片段分成两管扩 增，以在一管反应出现问题的时候，可以将两个反应分开进行验证。例如出现非专一性扩增 时。
[0018] 本发明提供的CHD-Z专一性引物不是鸽子性别鉴定所必须的，使用者也可以仅使 用CHD-W引物进行扩增，扩增出结果者为雌性，扩增不出结果者为雄性，这种方法在实际使 用时可能因样本问题造成雌性的漏检，但仍具有较大的实用价值，例如，只需要在大量鸽子 中挑选几只雌性鸽子，可采用此法。
[0019] 本发明的PCR反应液可按如下组分配置，浓度可以适当调整：
[0020] CN 105177121 A 说明书 3/7 页
[0021] 优选的，在96孔PCR板中，单个PCR反应液配制可参考如下：
[0023] 优选的，在384孔PCR板中，PCR反应液配制可参考如下：
[0026] 分开两管时，单个PCR反应液配制参考分别如下：
[0027] CN 105177121 A 说明书 4/7 页
[0028] 上述反应体系中，CHD-W和CHD-Z上下游引物（SEQ ID NO :1-4)是通过上海生工 引物合成公司合成，加入PCR反应体系时的浓度为2. 5uM.
[0029] qPCR MasterMix采用市售试剂盒，本发明的实施例是采用江苏楚天生物科技有限 公司商品试剂，货号CTB103。主要成分是SYBR染料、ddNTP、镁离子、热启动DNA聚合酶等。
[0030] 样本DNA是采用市售DNA提取试剂盒提取，使用浓度在0· l-10ug/ml，0D260/280 在1. 7