-2. 0之间。
[0031] 采用常规PCR时，PCR反应体系设计与上述基本相同，只需将市售qPCRMaster Mix 换成市售PCR Master Mix即可，主要成分是ddNTP、镁离子、热启动DNA聚合酶等，不含荧光 染料。
[0032] 上述PCR反应液配比只作为参考，实验人员对总反应体积和反应液体系进行适当 调整，也可获得理想的实验结果。
[0033] 实时荧光PCR或常规PCR反应程序设置参考如下
[0035] 实时荧光PCR或常规PCR熔解曲线分析程序参考如下
[0037] 上述PCR反应程序和熔解曲线分析程序只作为参考，实验人员对反应程序作出适 当调整，也可获得理想的实验效果。
[0038] 常规PCR凝胶电泳过程为本领域技术人员常规操作，此处概述：
[0039] 1.制备2%琼脂糖凝胶，待其凝固后置于电泳槽内，添加 TAE电泳缓冲液至没过胶 块
[0040] 2.将PCR产物与上样缓冲液混合后，加入胶孔中
[0041] 3.电压60-100V，跑胶30分钟
[0042] 4.用溴化乙锭溶液染色后置于紫外灯下，观察电泳条带。
[0043] 本发明还提供了一种高通量的鸽子性别鉴定方法，可以一次检测几十到几百个鸽 子DNA样本。由于每个样本只需采用一个PCR反应管，通过市售96孔或384孔PCR板，可 以实现一次检测96个或384个样本的性别鉴定，通过按比例缩放反应液，还可适用于更高 通量的集成化检测。
【具体实施方式】
[0044] 本发明可采用多种实施方式：
[0045] 1.常规PCR+凝胶电泳
[0046] a按照上述试剂配方或按比例缩放，也可对试剂组分进行适当调整，配制常规PCR 反应液
[0047] b.按上述PCR反应程序或适当调整的反应程序进行PCR反应
[0048] c.按照上述凝胶电泳步骤进行电泳，观察条带
[0049] 结果判定：在IOObp以下（83bp)，100_200bp之间（116bp)各出现一条带的为雌 性，仅出现100_200bp之间（116bp) -条带的为雄性。
[0050] 2.常规PCR程序+熔解曲线分析
[0051] a按照上述试剂配方或按比例缩放，也可对试剂组分进行适当调整，配制常规PCR 反应液
[0052] b.按上述PCR反应程序或适当调整的反应程序进行PCR反应
[0053] c.将反应后产物移至熔解曲线分析仪上，按上述熔解曲线分析步骤或仪器自带的 分析步骤进行熔解曲线分析。
[0054] 结果判定：熔解曲线出现双峰，其中一个峰在75. 7°C左右，另一个在78. 3°C左右， 为雌性，仅出现78. 3°C左右单峰为雄性。
[0055] 3.实时荧光PCR+熔解曲线分析
[0056] a按照上述试剂配方或按比例缩放，也可对试剂组分进行适当调整，配制实时荧光 PCR反应液
[0057] b.按上述PCR反应程序和熔解曲线分析程序或适当调整的程序进行PCR反应和熔 解曲线分析
[0058] 结果判定：熔解曲线出现双峰，其中一个峰在75. 7°C左右，另一个在78. 3°C左右， 为雌性，仅出现78. 3°C左右单峰为雄性。
[0059] 上述熔解曲线温度根据PCR反应液的配方不同可略有调整。
[0060] 实施实例
[0061] 鸽子的性别鉴定
[0062] 1.采取带有鸽子遗传物质的样本，如羽毛、血液、粪便、唾液等
[0063] 2.采用市售DNA提取试剂盒或通用DNA纯化步骤提取样本的DNA，也可采用直接 PCR方法，无需DNA纯化步骤
[0064] 3. PCR反应液配制
[0065] 在96孔PCR板中，单个PCR反应液配制参考如下：
[0067] 4.设置PCR反应程序
[0068] PCR反应程序如下
[0070] 熔解曲线分析程序如下
CN 105177121 A 说明书 7/7 页
[0074] 实验结果图片见说明书附图1-7.
[0075] 说明书附图
[0076] 图1样本编号1，熔解曲线分析结果
[0077] 图2样本编号2,熔解曲线分析结果
[0078] 图3样本编号3,熔解曲线分析结果
[0079] 图4样本编号4,熔解曲线分析结果
[0080] 图5样本编号5,熔解曲线分析结果
[0081] 图6样本编号6,熔解曲线分析结果
[0082] 图7凝胶电泳结果图，从左至右依次为：分子量标准品DL2000,样本1，2, 3,4, 5,6。
【主权项】
1. 一种鸽子性别鉴定方法，包括下列步骤： ⑴加入引物对、模板DNA、PCR MasterMix，配制PCR反应液 (2) 设定PCR反应程序 (3) 分析PCR反应结果 其特征是，所述的引物对是分别针对CHD-W和CHD-Z基因的2对特异性引物，引物序 列分别如SEQ ID NO :1-4所示，其中，SEQ ID NO :1是CHD-Z的5'引物，SEQ ID NO :2是 CHD-Z 的 3' 引物，SEQ ID NO :3 是 CHD-W 的 5' 引物，SEQ ID NO :4 是 CHD-W 的 3' 引物。2. 如权利要求1所述的鸽子性别鉴定方法，其特征是，所述的PCR反应液可按如下组分 配置，也可以适当调整：〇3. 如权利要求1所述的鸽子性别鉴定方法，其特征是，所述的PCR反应程序可按如下设 置，也可以适当调整：4. 如权利要求1所述的鸽子性别鉴定方法，其特征是，可以采用熔解曲线分析来分析 反应结果，其判定标准如下：熔解曲线分析：熔解曲线分别在75. 7°C左右、78. 3°C左右有 吸收峰的为雌性，只在78. 3°C有吸收峰的为雄性，根据不同的PCR反应体系及使用仪器的 差异，熔解曲线吸收峰值稍有变化。5. 如权利要求1所述的鸽子性别鉴定方法，其特征是，还可以采用凝胶电泳分析来分 析反应结果，其判定标准如下： 凝胶电泳分析：在116bp，83bp分别出现条带的为雌性，只有116bp出现条带的为雄性。6. 如权利要求1所述的性别鉴定方法，可适用于目的片段和鸽子具有同源性的其他非 平胸鸟类的性别鉴定。7. 如权利要求1所述的鸽子性别鉴定方法，可以仅使用W引物对，而不使用Z引物对， 判断标准为扩增出W片段即为雌性，可用于筛选雌性鸽子。
【专利摘要】本发明提供了一种新颖的鸽子性别鉴定PCR方法，包括检测鸽子性别决定基因CHD-Z和CHD-W的特异性引物和PCR方法，利用这种方法既能够在一管内同时扩增CHD-Z和CHD-W的特异性片段，也可以在两管内单独扩增CHD-Z和CHD-W的特异性片段来验证结果，既可以用熔解曲线分析，也可以用凝胶电泳分析，方便、准确、灵活地鉴定鸽子的性别。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105177121
【申请号】
【发明人】雷向东
【申请人】南京安阔医疗科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月18日