专利名称：通过间期细胞核的探针荧光原位杂交检测染色体间不平衡的方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过间期细胞核的荧光探针原位杂交(FISH)(hybridation in situ de sondes fluorescents)，检测染色体间不平衡的方法。它还涉及实施所述方法的一系统。
背景技术：
新生婴儿身上最常见的组成染色体不平衡涉及染色体21、18、13及性染色体。三体性染色体21(唐氏先天愚征)即为最常见的一种异常婴儿患病率约为千分之1.7(Stoll et al，1998)。
三体性染色体21发病数随母亲年龄增大而增加，尤其母亲年龄超过35岁时，所以若高龄生育，建议作产前检查。现在的趋势是晚育35岁以上才生小孩的母亲的百分比在四年间，从8％增至19％(Stoll et al，1994)。显然，这个比例还会继续增加，但从现在开始，法国每年新生婴儿数为750 000个，需作三体性染色体21检查的可能约为每年150 000例。
自70年代以来，羊膜腔穿刺术后的产前检查采用的是传统的细胞遗传学，所述细胞遗传学可确定中期染色体的染色体组型，并可检测染色体异常数。这种技术的主要缺点在于取样与得出诊断结果之间的等待期相对较长(2周)。另外，可利用中期不能百分百保证(失败率为1％)，由于母细胞的存在，可能会出现假阴性(Vermaet al，1998)。
最近，荧光探针的原位杂交(FISH)可直接应用在间期细胞核上，无需细胞培养。所述技术在于借助荧光探针，标注出染色体(如可参见US 5 756 696)或染色体区，并计算信号，即放射出荧光信号的染色体(Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996；Wei et al，1997；Eiben et al，1999)。因此，可在较短时间内得出结果(几天)，分析也只需取样少量细胞(几百个)，而细胞培养则必需更多细胞(至少好几万)。
不同类型的探针可用于这些研究覆盖染色体21中心区或长臂区的探针(cosmide，YAC)(Soloviev et al，1995，Van Opstad et al，1995；Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996)。通过用这些探针对染色体21所作的部分标注，可估计复制数。因此，必须人工或自动计算信号，以检测出对应染色体21的有三个信号的细胞。
不少研究证明了胎儿细胞(cellules fétales)原位杂交技术的可靠性。但很少研究可获得FISH技术与传统细胞遗传诊断法之间直接比较的结果(Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996；Wei et al，1997；Eiben et al，1999；Thein et al，2000)。这些研究的工作人员证明了这两种方法之间的一致性高达97--100％，但也强调诠释间期FISH结果的困难性。这些困难通常与必需一名人工操作员有关，所述操作员需识别并计算荧光信号。但不同操作员之间存在一定程度的变化，尤其地，信号异常数的细胞核数目的统计含义，会在诊断时造成一些问题。观察者之间的差异不仅因为采用了不同的对“点”(即荧光信号)的定义标准，例如，其大小、强度、结构，还因为点通常在沿核内垂直轴Z的不同焦点平面里。
因此，根据这些标准得到的结果也大为不同，所述标准本身又取决于各实验室中的样本准备。极大的偏差是由“定点(cut-off)”的确定造成的，即一“正性临界”值，根据所述值，样本可被视为异常(Ruangvutilert et al，2000)。所述值很难确定，因为在对照情况中，存在三个信号的细胞核的百分比在被分析核的10至20％之间。所述数目视研究而不同，因为被分析细胞数本身又在50到200之间变化，这可解释所述统计结果的极大差异性。另外，要对所述检测进行医学解释，重要的是要可靠地识别有染色体数目异常的细胞核(嵌合mosaique))的比例的值。
本发明的目的在于提出一种自动化检测方法，甚至从其概念就可看出，所述方法因此可消除由于人工操作员读取产生的困难，可解决由于样本准备的差异而造成的问题，到目前为止，这仍影响着分析的结果。
所述目的依靠一检测方法得以实现，所述方法即使用一信息化系统，通过对间期细胞核作探针荧光原位杂交，以检测染色体间的不平衡，所述检测方法包括以下阶段——对两不同染色体作探针荧光原位杂交，——用不同荧光染料显现各探针，——测量所有细胞核的分别对应于所显现各探针的信号强度，所述测量，一方面在对照细胞群体内、另一方面在被检测细胞群体内实施，——计算分别对应所述探针的所述信号之间的比，所述比率计算，一方面需计算所述对照细胞群体的比以提供一参考比，另一方面，需计算所述被检测细胞群体的比，——比较对应于被检测细胞群体的信号之间的比与参考比，——处理所述比较结果，以检测染色体间的不平衡。
本发明在于通过原位杂交提供一种技术，所述技术可利用与所研究的细胞对应的一特殊序列的探针，辨识出AND(或ARN)序列。所述技术基于核苷酸的补充性上(A/T，A/U，G/C)，它可在染色体、细胞或组织培养的精确的物理化学条件下实施。原位杂交方法的结果即在探针与目标之间形成杂交。原位杂交包括一变性阶段，这个所谓探针与目标的原位杂交阶段，及一检测杂交或探针阶段，在荧光原位杂交范围内，探针以荧光团标记着，荧光标记显现出杂交。所述技术的最新发展可使甚至在准备的同时看到分别由不同荧光团显现的多个探针。
有利地是，测量分别对应于各探针的两个或多个信号可通过图象细胞计数法来实施。例如，两探针可分别用一绿色荧光染料和一红色荧光染料显现。
因此，发展出一种图象细胞计数方法，所述方法既有通过FISH法分析间期细胞核的优点，又具备快速、准确、可量化及客观的读取信号的优点，因为它不受观察者的影响。
所述方法在于使用染色体的染色体染色或染色体区，所述染色体一方面具有不平衡的染色体，另一方面还有另一染色体(常染色体或性染色体)，选择该后一染色体是为了使利用染色体染色所获得的杂交信号与由不平衡的染色体染色所获得的信号进行比较。实际上，参考染色体和不平衡染色体在可能的测量范围内大小相近。因此，例如，所述方法在于，一方面使用染色体21、另一方面使用染色体20或22的染色图象或染色区；染色体20或22可当作参考染色体，因为用染色体21的图象所获得的杂交信号可与用大小相近的染色体20或22的图象所获得的信号相比较。至于染色体13的非整倍性(例如三体性染色体13)，参考染色体最好选择染色体14或15。至于染色体18的非整倍性(例如三体性染色体18)，参考染色体最好选择染色体17、19或20。至于染色体X的非整倍性，例如，参考染色体最好选择染色体6、7、8、9、10、11和12。至于染色体Y的非整倍性，参考染色体最好选择染色体19、20、21和22。
根据一最佳实施方式，原位杂交中所实施的探针为染色体染色探针。所谓“染色体染色探针”或“染色体染色”即指一探针，所述探针的成分在杂交条件下，适于和一目标杂交，所述目标包括一有多染色体组的预定染色体。若在与探针的所述成分发生杂交的样本中仅有一个所述染色体片段存在，则这一片段发生杂交并被识别出来。事实上，染色探针可与第二、第三等......混合，以便同时对预定的第二、第三......染色体作出标记和进行检测。目前，市场上有各种不同的染色探针(GIBCO-BRL；ONCOR BOEHRINGER-MANHEIM；......)。它们的制作或通过IRS-PCR放大法(如可参见WO 00 22164)，或通过使用染色体的已退化起爆剂PCR的DOT-PCR法，或通过染色体分类隔离出的染色体片段，或使用流体血细胞计数法或染色体微解剖法。另外，本发明中所实施的探针为这类探针，所述探针覆盖中心区(卫星ANDα)，一染色体臂(例如聚合序列TTAGGn)的全部或部分，或一个或多个染色体的特殊重复AND序列的特殊性(典型卫星AND 1、2及3)。
根据一最佳实施方式，染色体染色探针由一非同位素实体如发光剂、着色剂或其它来标记。所述标记可间接实施用酶、生物素、抗生物素蛋白、steptavidine、digoxygénine、半抗原或其它可用发光剂或着色剂来显现的物质。根据激励能量源的发光剂可归为几类发光无线电波、化学发光、生物发光、光激发光(包括荧光和磷光)。“荧光”一词通常指当所述物质被一能量源如紫外线激励时，一种可发光物质(如荧光团)的特性。最好用荧光来标记探针。
在本发明中，发明者提出对动物或人体间期细胞——最好在来自羊水或母体血液的胎儿细胞内——进行染色体间不平衡的检测。例如，先天或后天(如癌症)染色体不平衡检测还可在循环血液细胞、皮肤细胞、口腔细胞中进行，更广泛地说，可在方便可用的任何细胞类型中进行，以实施诊断检查。
在本发明中，发明者提出检测染色体间的不平衡，而不是检测被分析染色体的复制数目——染色体21、22(例如)的探针原位杂交后，各探针可用不同荧光团显现(绿和红)；——利用图象血细胞计数，在系统识别后，可在对照细胞群体及待检测细胞群体内，测量最少上百个细胞核(例如500)的各探针的强度；——计算各探针的两强度信号之间的比，将其与正常的基准值相比较，这样可确定至少有一个多余数字的染色体存在(例如染色体21)。这样，染色体间的不平衡则大于1，若为三体性染色体，则等于1.5。计算各探针的两强度信号之间的比，还可通过与正常基准值相比，确定是否存在单染色体。若有，则染色体间的不平衡为0.5。
根据本发明的检测方法与现行的检测方法相比，其优点在于——由于采用FISH技术，根据本发明的检测方法可避免与细胞培养相关的所有缺陷，得出结果也更快(几天)，且可采用的细胞，统计学上数量相当大，甚至对贫细胞样本也没有限制(细胞数约在500与约上千之间)。
——采用所述方法，不再存在所有与人工操作员读取和解释相关的困难，因为是由信息化系统自动进行分析。尤其地，间期细胞核的识别——在所述核中，与各探针杂交相关的所有荧光性强度测量——使得分析比采用目前所用的荧光信号的识别及计数(计算点或《spot counting》Tkachuk et al，1991)的方法简单可靠得多。
另外，即使使用小尺寸的探针，也可给出用于计数的更高分辨率的信号，所述信号因而更容易与背景噪音杂交在一起，因此信号与噪音之比很小，尤其因为羊水中包含有蛋白质膜，所述膜是主要的背景噪音源。发明者使用染色体染色的方法，由于所获得信号的尺寸，可确保信号与噪音之比大于用小尺寸信号计数法的信噪比。
由于羊水采样的特征，背景噪音的估测及消减可在困难条件下检测出三体性染色体细胞。
另外，与样本准备相关的差异问题不会再影响到分析。实验条件的可能变化不会改变荧光性之比，因为两信号会同样受到影响。利用最佳的统计准确度，能更可靠地检测细胞群体内两个群体的存在，因为能快速分析更多数量的细胞核。这样可识别感染了母细胞的病例或嵌合病例(即只有部分胎儿细胞出现异常)。
最后，无论所改变的染色体性质如何，都可更可靠地检测特殊病例，包括细胞等臂染色体(des iso chromosomes)21或易位t(21；21)(Stoll et al，1998)。用染色体染色显现出一斑点，所述斑点的大小及强度都应增加一倍；考虑到信号的大小，用适合的摄像头进行测量仍然更准确。所述方法不仅可应用在涉及染色体13、18、性染色体的其它病理学中，还可应用在其它病理学中，其中出现染色体数目不平衡(单染色体、三体性染色体、四体性......、多体性)。需注意，荧光探针的原位杂交FISH技术已在已公布专利申请FR2783253中描述的一种不同方法中实施过，所述专利申请是关于更准确地检测间期细胞核内的染色体内的不平衡，以检测整个或部分染色体臂的遗传物质的遗失或增加(删除、插入、扩大、复制......)。在所述检测方法中，染色体的长臂及短臂的两各不同的特殊荧光团标注的两探针，在所述同一染色体上发生杂交。
在根据本发明的方法的一特别优化实施例中，测量阶段包括一获取步骤，即在一确定的测量平面内，获得一定数量的区域，以便对于确定图象的放大获取至少预定数目的可分析细胞核(成百上千)。
另外，获取阶段还包括利用一窄通频带的连续光学过滤，捕获对于各观察区分别对应于与众多荧光染料波长相对应的众多平面的数个图象(例如，蓝色荧光的4.6-Diamidino-2-phénylindole(DAPI)，绿色荧光的荧光素isothiocyanate(FITC)，红色荧光的Texas RedTM)，存储所述获得的图象，并把所述获得及存储的图象重叠在一起。
根据本发明的另一特征，它提出一种系统，以通过间期细胞核的荧光探针原位杂交，检测染色体内的不平衡，所述系统可用于实施根据本发明的方法，它包括——用于对两不同染色体实施荧光探针原位杂交的装置，——用不同荧光染料显现各探针的装置，——测量分别对应于如此显现的各探针的强度信号的一装置，所述测量一方面在对照细胞群体中、另一方面在所述待检测细胞群体内的一组细胞核进行，——计算分别对应于所述探针的所述信号之间的比的装置，一方面需计算关于所述对照细胞群体的以提供一基准比，另一方面需计算关于所述被检测细胞群体的，——比较对应于被检测细胞群体的信号之间的比与基准比的装置，及——处理所述比较结果以检测染色体间不平衡的装置。
有利地是，图象血细胞计数装置包括——应用于细胞群体的多荧光显微镜装置，所述细胞群体预先进行了不同的荧光探针原位杂交，
——用于获取由荧光显微镜装置产生的所有图象的装置，——用于存储所述所获图象的装置，及——分析所述所获取并存储的图象的装置。
荧光显微镜装置及图象获取装置协作，以在一定测量平面内，获得一定数量的区域，以对于放大某一图象可获得至少预定数量的可分析细胞核。
在根据本发明的一检测系统的最佳实施例中，所述检测系统还包括一过滤装置，所述过滤装置与荧光显微镜装置及获取装置协作，可获得多个图象，所述图象分别对应各区域里众多平面，所述平面又和众多荧光染料的波长相对应(例DAPI，FITC(绿色)，Texas Red(红色))。
此外，有利地是，荧光显微镜装置及获取装置可协作，以在同一研究平面内，获得对应于对照细胞群体的图象及对应被检测细胞群体的图象。
本发明的其它特征和优点可在后文中参照附图，以非限制性方式详细描述一实施例中体现出来，附图中——图1示出了根据本发明的检测染色体不平衡的方法的主要步骤；——图2简略示出了根据本发明的一检测系统的结构；及——图3中的代表性方框图示出了对由根据本发明的检测系统所获得的图象实施的检测及量化操作。
具体实施例方式
尤其如图1所示，在实施根据本发明的检测方法的一实施例中，首先描述检测及量化阶段之前的初始准备及杂交阶段。
样本准备先准备好目前来自羊水的待检测样本，如可在平板上作传统细胞遗传分析，即指培养或直接分析采样。但为提高对平板的自动分析，推荐使用井式离心机——所述离心机可使平板精确展开(如细胞旋转(cytospinTM))，以平坦地展开细胞。这可减少自动读取过程中在“焦点”外的细胞数量。有限的展开还可缩短图象获取时间。
培养的羊水样本按传统产前诊断程式处理。要直接分析羊水，可在作完胃蛋白酶处理后，再用分解细胞团的介质处理。
展开还可利用一井式离心机实施。对照平板可根据相同程式，用正常羊水或正常纤维原细胞准备。另外，还可分析血液样本。若采样来自母体外围血液时，可预先作胎儿细胞检测。
探针准备染色体染色的原位杂交可按通常程式实施(Truong et al，1998)。先把平板在2SSC盐水溶液中浸泡15分钟，然后用PBS缓冲液冲洗，再放在0.01N(4μg/ml，SIGMA)HCI中10分钟，作胃蛋白酶处理。用PBS溶液中止溶解5分钟，再把平板放在Carnoy(乙醇/乙酸3∶1(v/v))中浸泡10分钟，最后拿出试条晾干。
探针在10分钟内，在70摄氏度时，在PH值为7的70％的甲酰胺(FLUKA)/2SSC溶液中变性。目标AND，即平板上的细胞核在3分钟内，在相同条件下改变性质。再用2SSC溶液冲洗平板，用一系列酒精溶液脱水。探针杂交会在黑暗中37摄氏度时发生。杂交后的洗涤即放在72摄氏度的缓冲液2SSC中5分钟。
若使用地高辛(digoxigénine)或生物素标注的探针，探针的检测是通过使用与不同荧光染料(绿及红)搭配的抗体来实施。
若使用直接用荧光染料标注的探针，平板放在DAPI(1μg/ml，分子探测器)中会立即染上颜色，若在p-phenyl-diamine(二元胺苯基)中则会显现出匹配。
探针荧光信号的检测及量化方法如图2所示，在根据本发明的染色体间不平衡检测系统中所实施的图象细胞计数装置1包括有一荧光显微镜2的获取部分10、一黑白冷却(refroidie noir et blanc)摄像机CCD5——所述摄像机可允许40微秒到10秒的集成时间、可自动改变由荧光试条4——所述荧光探针安放在灯与显微镜3之间，并可能在显微镜3、摄像机CCD5及X、Y型机动样本平板搁板13之间，所述平板搁板由装置1自动控制以便系统采样——激励并发射的光线光谱的一装置(机动过滤器支承轮或机动过滤器支承架)、及一处理和控制部分14，所述部分由一计算机构成，所述计算机尤其包括一图象获取卡。
荧光性测量分为两步1)在所研究平板上确定一分析区域后，获取并存储图象。
2)分析图象，并利用分析图象得出的数据。
第一步骤在于，在一确定表面内，获得多个给定数量的区域，利用40x放大物镜，以得到500到1000个可分析的细胞核。利用选择性干扰光学过滤器，用CCD摄像机获取到图象。把各区域中对应不同荧光染料(蓝、绿及红)波长的三个图象平面存储并叠放在一起(如图2所示)。确定基准点，以避免被观察区域处在焦点之外。因而可在相同条件下(尤其是相同的集成时间、相同的摄像机拍摄内容)，分析被检测的平板11及对照平板12。
包括细胞核检测及信号量化的第二步骤中，如图3所示，需进行以下各阶段1)分割各图象，检测待分析的细胞核，所述阶段包括分离开细胞核团，并根据尺寸及形态标准排除假象(artifact)，这可在负染色平面内设立起一层细胞核护罩(masque)，例如在DAPI中，在其中测量荧光性强度。
2)量化各细胞核内的各荧光染料(红及绿)的强度，所述强度对应由各探针所发射的荧光，完全不必假设信号的形状及位置。
3)量化各区域内在细胞核外各颜色的背景级；确定最常见的噪声级为参考值。
4)减去各探针核内的背景级(参考值)。
5)计算各核根据基准值校正过的绿/红强度之比。
6)用图形表示数据，例如柱形图或“散点图”(两色彩强度值的二维式图形)。
7)自动确定通过簇分析——即分析雪点，确定这些雪点的重力中心——而选择的一细胞核群体的荧光性之比的均方根偏差及平均值。
在相同条件下，用相同方式计算各样本的荧光性之比。因此，若标准化的病人样本的荧光性与对照样本的荧光性之比为1.5，则可检测出三体性染色体21。
当然，本发明并不局限于上面所描述的实施例，可参照所述实施例延伸出许多构型，但这并未超出本发明的范围。因此，根据本发明的检测方法可适用于其它染色体X、Y、13及18中，或其它不常见的反常病例中。
检测系统的特征在于——图象细胞计数装置还包括用于检测细胞核及量化有众多波长的荧光性信号的若干装置；——装配检测及量化装置是为了通过形状、体积、荧光密度等多重标准——所述标准一般称为形态、密度计量学标准——的分析，以分割细胞核，使得为测量平面的所有区域设立起一护罩。
参考资料目录Eiben B，Trawicki W，Goebel R，Pruggmayer M，Epplen JT通过荧光原位杂交快速产前检测未培养羊水中的非整倍性染色体(Rapid prenatal diagnostics of aneuploidies in unculturedamniocytes by fluorescence in situ hybridization.)Fetal Diagn Ther 1999；14193-197Pierluigi M，Perfumo C，Cavani S，Lehrach H，Nizetic D，DagnaBricarelli F在未培养羊水中检测非整倍性染色体唐氏先天愚征的改善方法(An improved method for the detection of Down’s syndromeaneuploidy in uncultured amniocytes.)Clin Genet 1996；4932-36Ruangvutilert P，Delhanty JD，Rodeck CH，Harper JC检测非嵌合性三体性或三体性成纤维细胞的中期或间期FISH法的相对有效性(Relative efficiency of FISH on metaphase andinterphase nuclei from non-mosaic trisomic or triploid fibroblastscultures.)Prenat Diagn 2000；20159-162Soloviev IV，Yurov YB，Vorsanova SG，Fayet F，Roizes G，MaletP用位点特异性粘粒和粘粒毗连序列群探针经间期荧光原位杂交法对复制后的细胞进行21号染色体三体的产前诊断(Prenataldiagnostics of trisomy 21 using interphase fluorescence in situhybridization of post-replicated cells with site-specific cosmid andcosmid contig probes.)Prenat Diag 1995；15237-248
Steinborn A，Roddiger S，Born HJ，Baier P，Halberstadt E荧光原位杂交可只用几小时产前快速检测出非整倍性染色体异常(Fluorescent-in-situ-hybridization allows rapid prenatal detectionof fetal aneuploidies within few hours.)Z Geburtsh Neonatol 1996；200186-190Stoll C，Alembik Y，Dott B，Roth MP法国东北部流行性唐式先天愚征的近期发展趋势(Recenttrends in the prevalence of down syndrome in north-easternFrance.)Ann Génét 1994；37179-183Stoll C，Alembik Y，Dott B，Roth MP对238942名连续出生的婴儿所作的唐式先天愚征研究(Studyof Down syndrome in 238942 consecutive births.)Ann Génét 1998；4144-51Thein ATA，AbdeFattah SA，Kyle PM，Soothill PW评估把使用染色体特异性探针的间期FISH法当作产前诊断中细胞遗传检查的一种方法(An assessment of the use of interphase FISHwith chromosome specifique probes as an alternative tocytogénéticiens in prenatal diagnostics.)Prenat Diagn 2000；20275-280Tkachuk DC，Pinkel D，Kuo W.L，Weier A-U，gray J.W荧光原位杂交的临床应用(Clinical applications of fluorescencein situ hybridation.)Genetic analysis techniques and application 1991 April N°NewYork，USVan Opstad D，Van Hemel JO，Eussen BH，van der Heide A，Van den Berg C，In T Veld PA，Los FJ利用21号染色体特异性粘粒杂交物检测间期细胞核内的21号染色体异常(In‘T Veld PA，Los FJ.A chromosome 21-specificcosmid cocktail for the detection of chromosome 21 aberrations ininterphase nuclei.)Prenat Diagn 1995，15705-711Verma L，Macdonald F，Leedham P，MacConachie M，Dhanjai S，Hulten M唐式先天愚征法的快速、简单的产前DNA检测(Rapid andsimple prenatal DNA diagnostics of Down’s syndrome.)Lancet 1998；3529-12Wei HJ，Su TH，Chien CL，Tzeng CR利用荧光原位杂交法(FISH)作为检测非整倍性染色体细胞的一种方法(Fluorescenee in situ hybridization(FISH)as a method todetect aneuploid cells.)Fetal Diagn Ther 1997；12309-31权利要求
1.通过对间期细胞核作探针荧光原位杂交检测染色体间的不平衡的方法，所述检测方法包括以下阶段——对两个不同染色体作探针荧光原位杂交，——用不同荧光染料显现各探针，——测量一组细胞核的分别对应于所显现的每一探针的强度信号，所述测量一方面在对照细胞群体内进行，另一方面在被检测的细胞群体内进行，——计算分别对应于所述探针的所述信号之间的比，所述计算一方面在所述对照细胞群体中进行以提供一参考比，另一方面在所述被检测的细胞群体中进行，——比较对应于被检测细胞群体的信号之间的比与参考比，——处理所述比较结果，用于检测染色体间的不平衡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分别对应于各探针的两个信号的测量由自动图象细胞计数方法进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，两探针分别用两种不同的荧光染料来显现(例如，一绿色荧光染料、一红色荧光染料)。
4.根据上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，各探针的强度信号在可由操作员确定的数目的核，如约几百个，上测量。
5.根据上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，测量阶段包括第一获取阶段，在一确定的测量平面内获得一定数量的区域，以便对于给定图象放大率获取至少预定数目的可分析细胞核。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，获取阶段还包括利用连续光学过滤，对于各区域捕获分别与对应于多个荧光染料波长的多个平面相对应的多个图象(例如，负染色区为蓝色，探针标记为绿色、红色)，存储所述获得的图象，并将所述获得及存储的图象重叠在一起。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，对照细胞群体和被检测细胞群体的获取阶段在大致相同的获取条件下实施。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，分别对应于对照细胞群体及被检测细胞群体的获取在同一测量平面内的两个区域中实施。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，测量阶段还包括检测细胞核及量化荧光强度信号的第二步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，检测及量化步骤包括对一个测量平面内各区域中的细胞核进行分割。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，细胞核分割包括分离开细胞核团。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，细胞核分割包括根据尺寸及形态学标准排除假象。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其特征在于，检测及量化步骤包括对于对应于各探针的各种颜色量化结合到各细胞核内的各荧光信号强度。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，检测及量化步骤还包括对各颜色计算各区域内在细胞核外的背景级。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，检测及量化步骤还包括确定最常见的背景级作为噪声参考值，并利用所述参考值校正各细胞核内的已量化的荧光信号强度。
16.通过对间期细胞核作荧光探针原位杂交检测染色体间不平衡的系统，所述系统实施根据上述任一项权利要求所述的方法，该系统包括——用于对两个不同染色体实施荧光探针原位杂交的装置，——用不同荧光染料显现各探针的装置，——测量一组细胞核的分别对应于所显现的每一探针的强度信号的装置，所述测量一方面在对照细胞群体中、另一方面在被检测细胞群体中进行，——计算分别对应于所述探针的所述信号之间比的装置，所述计算一方面在所述对照细胞群体上进行以提供一参考比，另一方面在所述被检测细胞群体上进行，——比较对应于被检测细胞群体的信号之间的比与参考比的装置，及——处理所述比较结果以检测染色体间不平衡的装置，如嵌合的情况。
17.根据权利要求16所述的检测系统，其特征在于，它包括一图象细胞计数装置作为所述测量装置。
18.根据权利要求17所述的检测系统，其特征在于，所述图象细胞计数装置包括——用于细胞群体的荧光显微镜装置，所述细胞群体预先被进行了探针荧光原位杂交，——用于获取由荧光显微镜装置产生的图象的装置，——用于存储所获取的图象的装置，及——分析所述获取的并存储的图象的装置。
19.根据权利要求18所述的检测系统，其特征在于，所述荧光显微镜装置及图象获取装置协作，以在一确定的测量平面内，获得一定数量的区域，以对于给定图象放大率获得至少预定数量的可分析细胞核。
20.根据权利要求19所述的检测系统，其特征在于，它还包括过滤装置，所述过滤装置与所述荧光显微镜装置及获取装置协作，用于获得多个图象，对于各区域，所述图象分别对应于多个平面，所述平面和多个荧光染料的波长相对应(例如负染色区为DAPI(蓝色)，探针为FITC(绿色)，Texas RedTM(红色))。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的检测系统，其特征在于，荧光显微镜装置及获取装置协作，用于在同一研究平面内获得对应于对照细胞群体的图象和对应于被检测细胞群体的图象。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的检测系统，其特征在于，图象细胞计数装置还包括用于检测细胞核及量化多个波长的荧光信号的多个装置。
23.根据权利要求22所述的检测系统，其特征在于，所述检测及量化装置被配置为用于根据形态学测量和密度测量分析对细胞核进行分割，以便为测量平面内的一组区域建立起一护罩。
24.根据权利要求22或23所述的检测系统，其特征在于，所述检测及量化装置被配置为用于分割细胞核团。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的检测系统，其特征在于，所述检测及量化装置被配置为用于根据尺寸及形态学标准排除假象。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的检测系统，其特征在于，所述检测及量化装置被配置为用于对于各颜色量化结合到各细胞核内的荧光信号强度。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的检测系统，其特征在于，所述检测及量化装置被配置为用于计算细胞核外各颜色的背景级。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的检测系统，其特征在于，所述检测及量化装置被配置为用于确定最常见的背景级作为背景参考值，并从各核内的已量化的强度中减去上述参考值。
29.根据权利要求1至15中任一项所述的染色体间检测方法在在母体血液中流动的胎儿细胞核上的应用。
全文摘要
本发明涉及通过间期细胞核的荧光探针原位杂交，检测染色体间不平衡的系统，所述检测包括以下阶段对两不同染色体作探针荧光探针原位杂交；由不同荧光染料显现各探针；测量细胞核组的分别对应于所显现探针的强度信号，一方面在对照细胞群体内测量，另一方面在被检测细胞群体内测量；计算分别对应于所述探针的所述信号之间的比，一方面需计算所述对照细胞群体的比，以提供一参考比，另一方面需计算所述被检测细胞群体的比；比较对应于被检测细胞群体的信号之间的比与参考比；处理所述比较结果，以检测染色体间的不平衡。
文档编号G01N21/64GK1558955SQ02817247
公开日2004年12月29日 申请日期2002年7月3日 优先权日2001年7月3日
发明者弗朗索瓦丝·苏萨利纳, 巴纳德·马尔富瓦, 巴纳德·迪特里约, 玛丽－诺埃勒·吉里, 库翁·特吕奥恩, 迪特里约, 马尔富瓦, 弗朗索瓦丝 苏萨利纳, 特吕奥恩, 蛋＠铡ぜ 申请人:伊姆斯塔图像和模型化策略，分析和实现, 国家科研中心, 居里研究所, 原子能委员会, 伊姆斯塔图像和模型化策略，分析和