专利名称：一种蛋白质膜内原位荧光衍生的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的荧光检测，具体地说是一种蛋白质膜内原位荧光衍生的方法，蛋白质在中空纤维膜中进行富集，然后将中空纤维膜浸没到荧光试剂中进行蛋白质衍生。
背景技术：
荧光检测具有极高的检测灵敏度。随着蛋白质组学的提出，有许多文章将荧光衍生的方法应用到了蛋白质的检测中。通过荧光衍生，蛋白质的检测灵敏度得到了极大的提高。但是，在较低浓度蛋白质的荧光衍生过程中存在问题。由于蛋白质的衍生反应是与浓度相关的，因此当蛋白质浓度
很低时，衍生效果较差，影响荧光检测过程。Banks等人[Lau， S. K.;Zaccardo， F.; Little, M.; Banks, P.. J. Chromatogr. A 1998， 809， 203-210.]
指出氨基酸可以被衍生的最低浓度为10—SM，蛋白质的衍生过程也相似。要解决低浓度蛋白质的衍生问题， 一方面可以选择反应活性高的荧光试剂，提高衍生反应效果；另一方面可以采用富集技术。衍生反应后对蛋白质进行富集的方法已经得到较为广泛的应用。Robert S.Foote等人[Foote， R. S.;Khandurina， J.; Jacobson， S. C.; Ramsey, J. M. Anal. Chem. 2005 ， 77，57-63.]在芯片上制作了多孔膜，利用此多孔膜对荧光衍生后的蛋白质进行富集。Nathalie Siri等人[Siri， N.; Riolet， P.; Bayle， C,; Couderc， R J.Chromatogr .， B 2003， 793， 151-157.]利用大体积样品堆积的方法对荧光衍生后的肽段进行富集。但是，衍生反应后对蛋白质进行富集的方法无法从根本上解决低浓度蛋白质荧光衍生效果差的问题。当蛋白质的浓度很低时，蛋白质与荧光试剂的反应效果很差，因此仅依靠衍生后富集无法从根本上解决问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质膜内原位荧光衍生的方法，利用此荧光衍生方法可以对低浓度蛋白质进行荧光衍生。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种蛋白质膜内原位荧光衍生的方法，
1) 蛋白质在中空纤维膜中的富集将蛋白质溶液通过泵从醋酸纤维素中空纤维膜的一端泵入醋酸纤维素中空纤维膜内，其另一端作为出口端，且出口端封闭；由于中空纤维膜的出口端被封死，因此蛋白质可以在膜中进行富集；
2) 富集后蛋白质的荧光衍生蛋白质样品富集后，进行荧光衍生，将富集有蛋白质样品的中空纤维膜螺旋式放到离心管中，再向离心管中加入
3PH=8.0- 10的荧光试剂溶液，并浸没中空纤维膜；对离心管进行加热并磁力搅拌，用于蛋白质的衍生。由于荧光试剂分子量较小，因此可以通过中空纤维膜侧壁的小孔扩散进入到膜内，与蛋白质分子发生反应，进行衍生。
在中空纤维膜的两端均插有毛细管，毛细管与中空纤维膜的连接采用毛细管插入中空纤维膜，环氧树脂胶封死连接处的方式来实现，如果毛细管外径小于中空纤维膜的内径，则可以直接将毛细管插入膜中，用环氧树脂胶密封连接处。如果毛细管外径大于中空纤维膜的内径，则可以将毛细管用氢氟酸刻蚀一段时间，当外径降低到小于膜内径时，再与膜连接；泵通过毛细管与中空纤维膜连接；于中空纤维膜的出口端的毛细管上设置有橡胶封头，用于封闭中空纤维膜的出口端。
所述毛细管的内径为25jam-150pm，外径不限；醋酸纤维素中空纤维膜的内径为200-400 pm，截留分子量为3000-8000 Da，有效长度不限。
所述蛋白质溶液的摩尔浓度为300pM-10|xM;泵入过程的流量为0.5-5)iL/min;泵入时间由中空纤维膜长度与蛋白质样品浓度决定，以蛋白质样品不产生沉淀为原则，可以在几分钟到几小时之间变动；加热温度为35-45 °C ，加热时间20-40分钟。
所述荧光试剂为在常规条件下可以进行蛋白质衍生的所有荧光试剂。
本发明的有益效果是
1. 可以对较低浓度蛋白质进行荧光衍生。由于低浓度蛋白质样品首先在中空纤维膜中进行富集，富集后膜中蛋白质浓度较高，因此，与传统的溶液衍生方法相比，荧光衍生效果会更好。
2. 装置简单，便于操作。本发明采用的实验装置包括毛细管，中空纤维膜，恒流泵，橡胶封头，离心管。装置比较简单。操作过程包括富集与衍生两个步骤，操作简便。
3. 成本低廉。由于实验所使用的物品比较便宜，因此成本低。
4. 具有良好的通用性，实用性强、具有较高的推广价值。本发明对常规的各种荧光衍生试剂均适用，而且衍生效果很好，可以很大程度地改善蛋白质的荧光检测效果。
图l为蛋白质样品富集过程示意图2为蛋白质样品富集后荧光衍生示意图；其中1，泵；2，毛细管；3，醋酸纤维素中空纤维膜；4，橡胶封头；5，离心管；6，荧光试剂。
图3为蛋白质膜内原位荧光衍生的方法与传统溶液衍生方法的比较图；其中，1:蛋白质膜内原位荧光衍生的方^; 2:传统溶液衍生方法。样品为0.05 mg/mL的bovine serum albumin溶液。
图4为蛋白质膜内原位荧光衍生的方法与传统溶液衍生方法的比较图；其中，1:蛋白质膜内原位荧光衍生的方法；2:传统溶液衍生方法。样品为10 jag/mL cytochrome C， 7 jig/mL myoglobin, 7 jig/mL bovine serum
4albumin的混合溶液。
具体实施方式
实施例
请参阅图1与图2，蛋白质膜内原位荧光衍生的方法包括两个步骤蛋白质在中空纤维膜中的富集；富集后蛋白质的荧光衍生。蛋白质的富集过程所需的部件包括泵1，毛细管2，醋酸纤维素中空纤维膜3，橡胶封头4。蛋白质样品由泵l驱动，以一定的流速不断流入中空纤维膜3中，由于中空纤维膜的出口被橡胶封头4封死，因此蛋白质可以在膜中进行富集。蛋白质样品富集后，进行荧光衍生。将富集有蛋白质样品的中空纤维膜螺旋式放到离心管5中，再向离心管中加入荧光试剂6，并浸没中空纤维膜3。对离心管进行加热并磁力搅拌，用于蛋白质的衍生。
毛细管2与中空纤维膜3的连接采用毛细管插入中空纤维膜，环氧树脂胶封死连接处的方法来实现。如果毛细管外径小于中空纤维膜的内径，则可以直接将毛细管插入膜中，用环氧树脂胶密封连接处。如果毛细管外径大于中空纤维膜的内径，则可以将毛细管用氢氟酸刻蚀一段时间，当外径降低到小于膜内径时，再与膜连接。
毛细管2的内径为25pm-150nm，外径不限；醋酸纤维素中空纤维膜(3)的内径为200-400 pm，截留分子量为3000-8000 Da，有效长度不限。应用例
毛细管(线性丙烯酰胺涂层)内径为100 pm，外径375jLim。醋酸纤维素中空纤维膜内径为200 pm，外径220 pm，有效长度为15 cm，截留分子量为3000。
蛋白质膜内原位荧光衍生的方法将蛋白质样品与6M盐酸胍溶液混合并加热变性。变性后，对蛋白质进行富集与衍生。蛋白质样品富集时，泵以1.5 pL/min的流速将蛋白质样品不断推入中空纤维膜中，进行富集。富集时间为60min。荧光衍生过程中，衍生反应温度为45。C，衍生反应时间为40min。衍生反应时，衍生体系为120 jiL 100mMNaHCO3-Na2CO3 (pH9.5) 、 150|LiL6M盐酸胍和20 pL 8 mg/mL荧光试剂(sw-cy3)的混合溶液。荧光衍生后，将样品收集并用HPLC-荧光检测法分析。
传统溶液衍生方法将蛋白质样品与6M盐酸胍溶液混合并加热变性。将变性后的蛋白质样品与荧光试剂混合进行衍生反应。衍生体系为120 pL变性后蛋白质溶液，150 pL 6 M盐酸胍和20 8 mg/mL荧光试剂(sw-cy3)的混合溶液。衍生反应温度为45。C，衍生时间为30min。荧光衍生后，将样品用HPLC-荧光检测法分析。
由图3与图4可以看出，对于单个蛋白质样品与混合蛋白质样品，蛋白质膜内原位荧光衍生的方法所得到的衍生效果与传统溶液衍生方法相比，有非常明显的改善。蛋白质膜内原位荧光衍生的方法在低浓度蛋白质荧光衍生方面具有明显的优势。
权利要求
1. 一种蛋白质膜内原位荧光衍生的方法，其特征在于1)蛋白质在中空纤维膜中的富集将蛋白质溶液通过泵(1)从醋酸纤维素中空纤维膜(3)的一端泵入醋酸纤维素中空纤维膜(3)内，其另一端作为出口端，且出口端封闭；由于中空纤维膜(3)的出口端被封死，因此蛋白质可以在膜中进行富集；2)富集后蛋白质的荧光衍生蛋白质样品富集后，进行荧光衍生，将富集有蛋白质样品的中空纤维膜螺旋式放到离心管(5)中，再向离心管中加入pH＝8.0-10的荧光试剂溶液(6)，并浸没中空纤维膜(3)；对离心管进行加热并磁力搅拌，用于蛋白质的衍生。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于在中空纤维膜(3)的两端均插有毛细管(2)，毛细管(2)与中空纤维膜(3)的连接采用毛细管插入 中空纤维膜，环氧树脂胶封死连接处的方式来实现，泵(1)通过毛细管(2)与 中空纤维膜(3)连接；于中空纤维膜(3)的出口端的毛细管(2)上设置有橡胶 封头(4)，用于封闭中空纤维膜(3)的出口端。
3. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述毛细管(2)的内径 为25 pm-150 )im，外径不限；醋酸纤维素中空纤维膜(3)的内径为200-400 pm，截留分子量为3000-8000 Da，有效长度不限。
4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述加热温度为35-45 °C，加热时间20-40分钟。
5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白质溶液的摩尔 浓度为300pM-10jiM，泵入过程的流量为0.5-5|aL/min。
全文摘要
本发明涉及蛋白质的荧光检测，具体地说是一种蛋白质膜内原位荧光衍生的方法，1)将蛋白质溶液通过泵(1)从醋酸纤维素中空纤维膜(3)的一端泵入醋酸纤维素中空纤维膜(3)内，其另一端作为出口端，且出口端封闭；由于中空纤维膜(3)的出口端被封死，因此蛋白质可以在膜中进行富集；2)将富集有蛋白质样品的中空纤维膜螺旋式放到离心管(5)中，再向离心管中加入荧光试剂溶液(6)，并浸没中空纤维膜(3)；对离心管进行加热并磁力搅拌，用于蛋白质的衍生。本发明的优点为可以对低浓度蛋白质进行荧光衍生；装置简单；便于操作；成本低廉。
文档编号G01N33/68GK101464465SQ20071015902
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者乔晓强, 孙良亮, 张丽华, 张玉奎, 张维冰, 振 梁, 玉 梁 申请人:中国科学院大连化学物理研究所