荧光标记的原位再活化的制作方法

荧光标记的原位再活化的制作方法
【专利摘要】在样本表面处局部地提供蒸气以允许荧光标记在真空室内发荧光。例如，纳米毛细管可以在相关区域附近分配液体，该液体蒸发来增加荧光标记附近的蒸气压力。荧光标记处的蒸气压力的增加优选地足够大以防止去活化或者使荧光标记再活化，同时真空室内的总压力优选地足够低以允许带电粒子束在极少或没有附加排空抽吸的情况下操作。
【专利说明】荧光标记的原位再活化
发明【技术领域】
[1000]本发明涉及在降低后的压力条件下的荧光标记的再活化。
发明背景
[1001]生物系统是极其复杂的。理解它们需要明白结构、功能与不同分辨率水平下的定位之间的详细关系的能力。一种相关的方法(其使用了光学显微术和电子显微术两者)产生最全面的结果。例如，光显微术信息可以用来识别样本中生物上重要的区域及其动态，电子显微术可以在固定和/或着色后用来分解那些区域内的结构细节。
[1002]一种用于研究细胞结构、分子动态和运动性的已经获得广泛接受的有力技术是应用重组基因技术将“报告(importer) ”基因链接到“相关基因(genes of interest) ”(GoI)。因此，当在正常基因转录/翻译过程中表达的具体GoI时，还将表达报告基因，从而产生小的、可检测蛋白，该蛋白以附着到由该GoI针对其编码的“相关蛋白(protein ofinterest) ” (PoI)上而结束。
[1003]被广泛接受的报告基因在与针对绿色荧光蛋白(GFP)而进行编码，可在野生型和转基因版中获得这些报告基因，并且所表达的GFP具有在发射波长在从蓝色扩展到红色的荧光。GFP相对小(29.6kDa，直径3nm，长4nm)，并且其色基在内部受到良好保护并且不需要任何针对光发射的辅助因子。在生物学环境下，“照亮(light up)”GFP所需的全部是在适当波长下通过激光的照明用于GFP激励和荧光衰减。
[1004]清楚地，如果可以在细胞内精确地确定GFP的X-Y-Z位置(例如，精度达IOnm)，则对PoI的位置了解将达到相似的精度。可以通过光显微镜观察到发荧光的GFP，并且从而可以相对于样本中可观察到的结构而看到PoI的位置。尽管不能用来看荧光，但电子显微镜可以用来在比光显微镜中可能实现的高得多的放大率下形成结构的图像。针对从各种荧光标记(如GFP、染料和量子点)获得高位置信息，已经建议并且在一些情况下证实了现有技术中的若干种技术。在一种技术(Buijsse等人的被转让给本申请的受让人的美国专利号为7，317，515的通过引用结合于此的题为“定位突光标记的方法(Method of LocalizingFluorescent Markers) ”中建议了这种技术,带电粒子束将对样本的表面进行扫描，当该束碰撞荧光标记时，会对标记造成破坏并且使荧光熄灭。然后，当荧光熄灭时，荧光标记的位置将对应于带电粒子束的位置。因为带电粒子束可以被聚焦成一个比照亮标记的激光小得多的点，并且将以高精度确定带电粒子束在其扫描过程中的任何时间时的位置，所以将以相似的精度确定荧光标记的位置和因此PoI的位置。
发明概述
[1005]因此，本发明的目标是在真空室中使用荧光标记改进结构的成像。
[1006] 申请人:已经发现当暴露在低压力(次大气压)环境下时荧光标记停止发荧光，并且当将荧光标记带回较高压力下时恢复荧光。
[1007]本发明的实施例在样本表面处局部地提供了蒸气以允许荧光标记在真空室内发荧光。例如，纳米毛细管可以在相关区域附近分配液体，该液体蒸发来增加荧光标记附近的蒸气压力。荧光标记处的蒸气压力的增加优选地足够大以防止去活化或者使荧光标记再活化，同时真空室内的总压力优选地足够低以允许带电粒子束在极少或没有附加排空泵送的情况下操作。
[1008]为了可以更好地理解以下本发明的详细说明，上文已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点。下文将描述本发明的附加特征和优点。本领域技术人员应认识到所披露的概念和具体实施例可容易地用作改进或设计用于实施本发明相同目的其他结构的基础。本领域的技术人员还应认识到这些同等构造不脱离如所附权利要求中所阐明的本发明的精神和范围。
附图简要说明
[1009]图1为一个图表,不出了突光强度vs真空室压力；
[1010]图2为一个图表，示出了荧光标记随时间的褪色；
[1011]图3为一个流程图，示出了本发明的实施例的步骤；
[1012]图4示意性地示出了通过纳米毛细管在表面上形成的液滴；
[1013]图5为一张显微照片，示出了通过纳米毛细管形成的液滴；
[1014]图6示意性地示出了一个包括离子束柱、电子束柱和光学显微镜的双束系统；以及
[1015]图7示出了一个用于照亮和观察荧光标记的光学显微镜。
优选实施方案的详细描述
[1016] 申请人:已经发现当暴露在降低后的压力(次大气压)环境下时荧光标记停止发荧光，并且当将荧光标记带回较高压力下时恢复荧光。
[1017] 申请人:在荧光标记附近局部地提供蒸气以防止去活化或在真空室内再活化荧光标记。在一些实施例中，在不将真空室压力增加到在其下带电粒子束柱变得不可用的点的情况下再活化荧光标记。在一些实施例中，真空室内的压力可以临时地上升到带电粒子束柱的操作压力以上，但蒸气的量值相对小并且可以将该室迅速地抽吸回降至操作压力。
[1018]本发明促进了相关显微术，因为可以将样本保持在用于电子显微术和/或离子束加工的真空系统内，还可以通过使用荧光标记的光显微术对其进行分析而不必将真空室排放至大气压。将工件保持在不需要排空的真空室促进了使用带电粒子束和光学显微镜的迅速的顺序操作。例如，可以使用离子束研磨暴露出工件的一部分、使用光学显微镜对其进行荧光标记定位，以及使用电子束使其成像。可以重复此过程以顺序地暴露出多个面，可以将这些面组合起来形成一张三维图像。
[1019]贯穿本发明在此的所有描述，术语“GFP”将用于表示在真空条件下会丧失荧光特性较大类别的荧光标记，包括GFP、有机染料以及无机标记，如量子点(其可以典型地被功能化成能够选择性地附着在具体细胞内组分上，如蛋白、核酸等。)
[1020]图1示出了绿色荧光蛋白的荧光强度vs真空室压力的图表。在显微镜载片上对GFP进行干燥并且将其暴露在大约IOmW的标称功率下的波长为385nm的光下。图1示出了当真空室内的压力降低时，荧光的强度降低。当压力降低到约400毫巴以下时，与大气压力荧光相比较，荧光降低两个数量级。当用室内空气排放该室时，荧光恢复。
[1021]众所周知的是许多荧光标记“褪色”，即当其暴露在光下时，经过一段时间后失去它们的荧光。图2示出了使用与图1的实验中所用的相同照明条件下荧光强度如何由于褪色而经过一段时间后降低。因此，图1为褪色引起的荧光降低量和真空压力减少引起的荧光降低量的卷积。为了确定由于真空引起的荧光降低量，人员将对图1的曲线与图2的曲线一起进行去卷积。然而，从图2中清楚看到，遍及图1中展现的数据的时间量程和使用这些照明条件，与所观察到的由于减少后的真空压力引起的荧光的降低量相比较，褪色不显著。
[1022]题为“微流体输送系统(Microfluidics Delivery Systems) ”的美国专利申请号13/693，938描述了用于具体地在排空室内局部地提供少量流体的方法和装置，该申请被转让至本发明的受让人并且其通过引用结合于此。微流体输送系统可以用来在真空室内局部地供应少量的液体。随着液体稳定地蒸发，蒸气压力局部地上升。局部蒸气压力的上升会使由于真空而去活化的荧光标记再活化。在平衡条件下，随着液体从泡沫中蒸发，液体不断地从纳米毛细管中流出以对泡沫进行补充。美国专利申请号13/693，938描述了用于对来自纳米毛细管的流速进行控制的装置。局部蒸气压力将与蒸发速率有关。
[1023]图3示出了一种对具有荧光标记的样本的多个切片进行观察的方法。在步骤302中，制备或“固定”具有荧光标记的生物样本以便在成像过程中使样本内的分子不动。例如，化学地或通过冷冻来对样本进行固定。在步骤304中，将样本装到包括带电粒子束柱和光学显微镜的系统的真空室内。该系统被配置成用于依次移除掉样本的小层以暴露出连续的横截面用于成像。可以将多个横截面的图像组合起来产生三维展示。在步骤306中，通过不对直接位于暴露表面下面的荧光分子造成破坏的任何方法来暴露出样本的表面。例如，在步骤360a中，将聚焦离子束引导向样本以清除材料从而暴露出表面。可替代地，在步骤360b中，通过使用显微切片机对来自样本的材料进行切片来暴露出表面。在另一个替代方案中，如步骤360c中所示，激光清除掉材料以暴露出材料的表面。激光可以是例如超高速脉冲激光，如通过烧蚀清除材料的飞秒激光。在步骤308中，将液体输送到暴露表面附近的区域。液体从暴露表面附近的区域蒸发并且将蒸气压力升到足够高以对荧光标记进行再活化。例如，纳米毛细管可以分配水，水蒸发从而在暴露表面处提供水蒸气。纳米毛细管中的开口的大小、真空压力和温度确定平衡蒸发速率，而蒸发速率确定暴露表面处的蒸气压力。
[1024]图4示意性地示出了在其中液体离开纳米毛细管402形成液滴404通过蒸气从液滴404中蒸发。如美国专利申请号13/693,938中所述，在平衡状态下，液滴的大小保持大约相同，其中，用“A”指示的液体以与用于“B”指示的蒸气离开液滴相同的速率流到该液滴内。图5示出了纳米毛细管502和液滴504的图像。
[1025]如美国专利申请号13/693,938中所述，可以形成一个通道来完全地或部分地包围住相关区域从而将液体从纳米毛细管引至相关区域以便在相关区域内保持较高的蒸气压力。纳米毛细管可以接触工件表面以在光学成像之前发起液体流。在光学成像之后，可以从表面升起纳米毛细管以使流动停止。纳米毛细管出口直径优选地足够小，从而使得液体通过毛细管作用流动。当打断纳米毛细管与表面的接触时，液体将停止流动。然后表面上的液滴将蒸发，其中，蒸气通过真空室扩散。这将减少相关区域附近的气体压力从而当没有正在是荧光标记成像时来改进带电粒子束成像。
[1026]在优选实施例中，真空室内的远离样本面的背景压力优选地保持在约1X10_3毫巴以下，而暴露面处的局部部分压力优选地大于约IX 10_2毫巴。更优选地，真空室内的远离样本面的背景压力保持在约IX 10_4毫巴以下，而暴露面处的局部部分压力大于约I X 10_2毫巴。样本面处的蒸气压力应足够再活化或保持荧光标记的活化，并且所需的压力将取决于荧光标记和样本制备。真空室内的背景压力优选地足够低以允许带电粒子束操作并且将取决于带电粒子束柱设计和操作参数。
[1027]在步骤314中，样本暴露在对荧光标记进行激励的照明辐射下，并且记录样本与荧光标记的光学成像。在决策框316中，使用者确定光学成像是否令人满意。如果图像不令人满意，则增加暴露表面处的蒸气压力。例如，可以使用更大的纳米毛细管，可以提升纳米毛细管的温度，可以提升(以增加纳米毛细管的流出量)或冷却(以减少从所分配流体的蒸发量)样本的温度，可以改变纳米毛细管相对于表面的位置，或者可以增加真空室内的压力。
[1028]如果带有荧光标记的光学图像令人满意，则在步骤318中获得暴露面的电子束图像。这典型地是扫描电子显微镜图像，其中，电子束跨暴露面进行扫描，并且收集次级电子。图像上点的亮度对应于所检测到的次级电子的数量。在步骤320中，光学图像的一部分和电子束图像被转换成相似的比例并且被彼此配准，从而使得可以在组合图像上看到两张图像的特征。光学图像给予关于GFP位置的信息以及因此相关特征(例如，GoI)的信息，而电子束提供高分辨率图像，这些图像包含有用光学方法不可容易获得的信息。这两张图像可以组合成一张图像而单独观察，或者通过对每张图像内存在的相对对比度进行调制而组
口 ο
[1029]在获得电子束图像之后，该过程返回到步骤316，在该步骤中，将材料从样本之前的暴露面上清除以暴露出新面。重复该过程直到在决策框322中确定收集到所希望的图像并且该过程在框324中终止。通过将不同深度的图像收集到样本中，可以构造出样本的三维展示。
[1030]在每个暴露面中，来自纳米毛细管的液体局部地提供所输送的蒸气，该蒸气或者防止表面内的荧光标记暴露在真空下和去活化，或者如果荧光标记已经被去活化则再活化
暴露表面。
[1031]如图1中所示，在实验条件下被照明的和在实验条件设置的温度下保持的这些GFP的特定实例中，为了再活化荧光标记，压力需要相当高，高于约400毫巴以便用所使用的收集光学器件获得可检测激励。此压力阈值取决于收集光学器件的效率、所存在的和发荧光的GFP的量值、样本的温度、激励照明的强度和其他实验条件。无论特定条件如何，获得激励荧光所需的压力显著地高于典型与电子显微术典型地所需的电子的长平均自由路径兼容的压力。虽然可以在每个切片之间完成对真空室的排放以使用荧光标记获得光学图像，但对每个切片之间的真空室进行排放和再排空将非常耗时。在使用环境扫描电子显微镜(ESEM)的情况下，其中可以在比较高的压力下将水蒸气带入室内同时仍然能够用电子束进行扫描，这种高压力不能与高分辨率电子束成像兼容，所以，在高真空与ESEM模式之间的切换涉及到的抽吸和排放时间也将长得不可接受。此外，抽吸和排放还会不可逆地改变还没有成像的大块样本内的GFP的性质。本发明的实施例消除了对通过提供高压力局部区域来进行排放和再排空的需要，该高压力迅速地消散以允许带电粒子束操纵用于进行切片或成像同时将总分析时间保持到合理的持续时间。
[1032]虽然上述过程使用了对液体产品进行分配来局部地产生蒸气的纳米毛细管，但其他实施例可以使用不同的技术增加样本周围的压力。例如，可以使用如题为“环境SEM注气系统(Environmental SEM Gas Injection System) ” 的美国临时专利申请号 61/677，226中或题为“注气系统(Gas Injection System) ”的美国专利号5，435，850中所描述的那个注气系统。在其他实施例中，可以通过增加真空室内的压力、降低样本温度或通过在真空室内在更高的压力下在环境小室内进行操作来增加样本周围的压力，尽管这种系统可能在观察之后需要过多的时间来恢复高真空模式用于带电粒子束操作。
[1033]因为液体输送系统容易地添加到现有系统上，所以可以在现有系统中实现本发明的实施例，这些现有系统包括用于对材料进行研磨以暴露出新面的聚焦离子束柱和用于扫描电子显微术或反向散射电子成像的电子束柱。图6示意性地示出了这种系统。
[1034]双束系统600包括被竖直定向的电子束柱602、偏离竖直方向大约52度下倾斜的聚焦离子束柱604、以及光学显微镜606。真空室610内的样本608安装在优选地可以在三个方向上移动并且还可以转动和倾斜的样本台612上。次级电子检测器614对通过来自离子柱604的离子束在样本上的冲击生成的或通过来自电子束柱602的电子的冲击生成的次级电子进行检测。在所示实施例中，电子束柱602和离子束柱604产生重合的束，即，它们在样本608上的大约同一斑点处冲击。光学显微镜的视野远离这些束的冲击点，并且样本台在光学显微镜的观察区和带电粒子束的操作区之间移动样本。通过光学显微镜对安装在显微操纵器622上的纳米毛细管620进行定位，从而使得可以将纳米毛细管移动成与样本表面接触以将液体流提供到该表面上从而提供对样本内的荧光标记进行再活化的蒸气。
[1035]这些柱的配置在不同实施例中可以不同。例如，在一些实施例中，离子束柱和电子束柱两者偏离竖直方向而倾斜。在一些实施例中，光学显微镜的视野与带电粒子束的冲击点重叠，即，两条束与光学显微镜重合。例如，离子束柱可以位于与包含电子束柱的平面垂直的平面内，其中，两个柱被定向成偏离竖直方向大约45°。可以对样本进行照亮并且从上方竖直地收集光。可替代地，光学柱和带电粒子束柱可以在同一平面内。
[1036]图7更加详细地示出了一种典型的光学显微镜。照明辐射源702通过光纤704提供光，该光传递通过385nm带通滤波器706并且被二向色反射镜708反射通过物镜710和真空室窗口 712传向样本714。该照明引起样本内突光标记发突光。来自样本的光传递回通过真空室窗口 712、物镜710、二向色反射镜708、并且通过带通滤波器718到达检测器720，该检测器使用来自荧光标记的光形成一张图像。带通滤波器718防止来自源702的光到达检测器720。
[1037]将理解到，光学图像的放大率将小于电子束图像的放大率。用于对图像进行缩放和对准的技术在相关显微术中是为人所熟知的，从而使得可以在电子束图像中检查使用荧光标记识别的结构。
[1038]根据本发明的一些实施例，一种对样本进行加工的方法包括:将样本放置在真空室内(a);排空该真空室(b);暴露出工件的新表面(C);在该新暴露表面处局部地提供蒸气同时在该真空室内保持背景真空压力，该背景真空压力低于该新暴露表面处的局部蒸气压力(d);照亮该新暴露表面内的多个荧光标记(e);获取该新暴露表面内的那些荧光标记的光学图像(f);以及重复步骤c至f。
[1039]在一些实施例中，该方法进一步包括形成每个新暴露表面的电子束图像。在一些实施例中，暴露出工件的新表面包括通过将聚焦离子束引导向该工件、通过将激光束引导向该工件或者通过使用显微切片机对该样本进行切割来清除掉材料。
[1040]在一些实施例中，在该新暴露表面处局部地提供蒸气包括使用纳米毛细管提供液体。在一些实施例中，该方法进一步包括:使该纳米毛细管接触到该样本表面以在光学成像之前引起液体流动；以及在形成该电子图像之间打断该纳米毛细管与该样本表面之间的接触。
[1041]在一些实施例中，该方法进一步包括对这些电子图像进行编译以形成该样本的三维展示。在一些实施例中，在该新暴露表面处局部地提供蒸气包括通过注气系统提供蒸气。在一些实施例中，该方法进一步包括将该样本冷却到比约_20°C更冷。在一些实施例中，该方法进一步包括将该样本加热到比约60°C更热。在一些实施例中，该新暴露表面处的局部蒸气压力大于1X10_2毫巴，同时该真空室内的背景真空压力小于5X10_3毫巴。
[1042]根据本发明的一些实施例，一种对真空室内的样本进行检查的方法包括:在该真空室内提供具有至少一个荧光标记的工件；将该真空室排空至小于IX 10_2毫巴的压力；在该荧光标记处提供增加该排空室内的荧光标记的活性的蒸气，该荧光标记处的蒸气压力大于该真空室内的背景蒸气压力；照亮该荧光标记；以及对从该荧光标记发射出来的光进行检测。
[1043]在一些实施例中，提供增加该荧光标记的活性的蒸气包括对来自纳米毛细管的液体进行分配，该液体蒸发以提供该蒸气。在一些实施例中，对来自纳米毛细管的液体进行分配包括对来自具有小于20 μ m的直径的纳米毛细管的液体进行分配。
[1044]在一些实施例中，该方法进一步包括使用扫描电子显微术形成该工件的图像。在一些实施例中，该方法进一步包括:通过清除掉材料来反复地暴露出该工件的新表面并且然后重复以下步骤:照亮该荧光标记；对从该荧光标记发射出来的光进行检测；以及使用扫描电子显微术形成该工件的图像。
[1045]在一些实施例中，该方法进一步包括对来自这些新暴露表面的图像进行编译以形成该工件的三维展示。在一些实施例中，该方法进一步包括将该样本冷却到比零下20°C更冷。在一些实施例中，该方法进一步包括将该样本加热到比60°C更热。在一些实施例中，由于所局部应用的蒸气引起的局部压力大于I X 10_2毫巴，同时该背景室压力小于5X 10_3毫巴。在一些实施例中，使用纳米毛细管提供液体包括将该液体提供到将该液体运向该新暴露表面的通道内。
[1046]根据本发明的一些实施例，一种用于对试样进行分析的系统，包括:真空室；用于对该真空室内的样本表面上的聚焦电子束进行扫描的电子束柱；用于对从该样本发射出来的次级电子进行检测的电子检测器以响应于该电子束的冲击以形成该样本的图像；用于使用引起该样本内的标记的荧光的光的波长照亮该真空室内的样本并且用于对来自该样本内的突光标记的突光进行检测的光学系统；以及用于向该样本表面局部地突光蒸气的蒸气源，该蒸气增加该真空内的荧光标记的活性同时在该真空室内保持较低的背景压力。
[1047]在一些实施例中，该蒸气源为对蒸发的液体进行分配的纳米毛细管。在一些实施例中，该蒸气源是注气系统。
[1048]在一些实施例中，该系统进一步包括用于对该样本进行加工的聚焦离子束柱。在一些实施例中，该系统进一步包括用于对该样本进行加工的激光。在一些实施例中，该系统进一步包括用于对该样本进行加工的显微切片机。在一些实施例中，该系统进一步包括能够将该样本加热至比60°C更热的加热器。在一些实施例中，该方法进一步包括能够将该样本冷却到比_20°C更冷的冷却器。
[1049]在一些实施例中，该室内的操作压力小于1X10_4毫巴。在一些实施例中，由于所局部应用的蒸气引起的局部压力大于IX 10_2毫巴，同时该背景室压力小于5X 10_3毫巴。
[1050]尽管已经详细描述了本发明及其优点，但是应理解到，在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围的情况下，可以在此进行各种变化、代替以及改变。本申请的范围并非局限于在本说明书中所述的工艺、机器、制造物、物质的组合物、手段、方法以及步骤的具体实施例。如本领域的普通技术人员将从本发明的披露中轻易认识到的，可以根据本发明利用现有的或往后要开发的、大体上执行相同功能或大体上实现和此处所述的对应实施例相同结果的工艺、机器、制造物、物质的组合物、手段、方法以及步骤。相应地，所附权利要求书是旨在于将此类工艺、机器、制造物、物质的组合物、手段、方法或步骤包括在它们的范围内。
【权利要求】
1.一种对样本进行加工的方法，包括: a.将该样本放置在真空室内； b.排空该真空室； c.暴露出该样本的新表面； d.在该新暴露表面处局部地提供蒸气同时在该真空室内保持背景真空压力，该背景真空压力低于该新暴露表面处的局部蒸气压力； e.照亮该新暴露表面内的多个荧光标记； f.获取该新暴露表面内的所述荧光标记的光学图像；以及 g.重复步骤c至f。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括形成每个新暴露表面的电子束图像。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，暴露出该样本的新表面包括:通过将聚焦离子束引导向该样本、通过将激光束引导向该样本或者通过使用显微切片机对该样本进行切割来清除掉材料。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在该新暴露表面处局部地提供蒸气包括使用纳米毛细管提供液体。
5.如权利要求4所述的方法，进一步包括: 使该纳米毛细管接触到该样本表面以便在光学成像之前引起液体流动；以及 在形成该电子图像之前打断该纳米毛细管与该样本表面之间的接触。
6.如权利要求2所述的方法，进一步包括:对所述电子图像进行编译以形成该样本的三维展示。
7.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在该新暴露表面处局部地提供蒸气包括通过注气系统提供蒸气。
8.如权利要求1或权利要求2所述的方法，进一步包括将该样本冷却到比约_20°C更冷。
9.如权利要求1或权利要求2所述的方法，进一步包括将该样本加热到比约60°C更热。
10.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，该新暴露表面处的局部蒸气压力大于I X 10_2毫巴，同时该真空室内的背景真空压力小于5 X 10_3毫巴。
11.一种在真空室内对样本进行检查的方法,包括: 在该真空室内提供具有至少一个荧光标记的工件； 将该真空室排空至小于I X 10_2毫巴的压力； 在该突光标记处提供增加该被排空的室内的突光标记的活性的蒸气，该突光标记处的蒸气压力大于该真空室内的背景蒸气压力； 照亮该荧光标记；以及 对从该荧光标记发射出来的光进行检测。
12.如权利要求11所述的方法，其中，提供增加该荧光标记的活性的蒸气包括对来自纳米毛细管的液体进行分配，该液体蒸发以提供该蒸气。
13.如权利要求12所述的方法，其中，对来自纳米毛细管的液体进行分配包括:对来自具有小于20 Mm的直径的纳米毛细管的液体进行分配。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，进一步包括:使用扫描电子显微术形成该工件的图像。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包括通过清除掉材料来反复地暴露出该工件的新表面并且然后重复以下步骤: 照亮该荧光标记； 对从该荧光标记发射出来的光进行检测；以及 使用扫描电子显微术形成该工件的图像。
16.如权利要求11至13中任一项所述的方法，进一步包括对来自所述新暴露表面的图像进行编译以形成该工件的三维展示。
17.如权利要求11至13中任一项所述的方法，进一步包括将该工件冷却至比_20°C更冷。
18.如权利要求11至13中任一项所述的方法，进一步包括将该工件加热至比60°C更热。
19.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中，由于局部应用的蒸气引起的局部压力大于I X 10 2毫巴，同时该背景室压力小于5 X 10 3毫巴。
20.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中，使用纳米毛细管提供液体包括将该液体提供到将该液 体运向该新暴露表面的通道内。
21.—种用于对试样进行分析的系统,包括: 真空室； 用于对该真空室内的样本表面上的聚焦电子束进行扫描的电子束柱； 电子检测器，其用于响应于该电子束的冲击而对从该样本发射出来的次级电子进行检测以形成该样本的图像； 用于使用引起该样本内的标记的荧光的光的波长照亮该真空室内的样本并且用于对来自该样本内的荧光标记的荧光进行检测的光学系统；以及 用于向该样本表面局部地应用蒸气的蒸气源，该蒸气增加该真空内的荧光标记的活性同时在该真空室内保持较低的背景压力。
22.如权利要求21所述的系统，其中，该蒸气源为对蒸发的液体进行分配的纳米毛细管。
23.如权利要求21所述的系统，其中，该蒸气源是注气系统。
24.如权利要求21至23中任一项所述的系统，进一步包括用于对该样本进行加工的聚焦离子束柱。
25.如权利要求21至23中任一项所述的系统，进一步包括用于对该样本进行加工的激光。
26.如权利要求21至23中任一项所述的系统，进一步包括用于对该样本进行加工的显微切片机。
27.如权利要求21至23中任一项所述的系统，进一步包括能够将该样本加热至比60°C更热的加热器。
28.如权利要求21至23中任一项所述的系统，进一步包括能够将该样本冷却至比-20°C更冷的冷却器。
29.如权利要求21至23中任一项所述的系统，其中，该室内的操作压力小于IX 10_4毫巴。
30.如权利要求21至23中任一项所述的系统，其中，由于局部应用的蒸气引起的局部压力大于1 X 10 2毫巴，同时该背景室压力小于5 X 10 3毫巴。
【文档编号】G01N21/76GK103994987SQ201410055087
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2013年2月19日
【发明者】A.P.J.M.波特曼, C.J.扎奇列森 申请人:Fei 公司