专利名称：一种原位杂交制片多次使用的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一种原位杂交制片多次使用的方法。
背景技术：
原位杂交技术的发展经过了从使用放射性同位素标记的探针进行的原位杂交到应用非放射性标记探针进行的原位杂交——荧光原位杂交，再到现在的细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)的历程，其定位准确性和检测灵敏度不断提高，应用范围越来越广泛。最初原位杂交是通过具放射性标记的探针检测细胞中特定基因在染色体上的位置、活性和表达。但随着分子细胞遗传学的发展和检测手段的提高，原有的同位素原位杂交表现出许多缺点，如每次检测均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，而且应用放射自显影需较长时间的曝光时间(有时长达数天甚至数星期)才能检测出信号，信号分辨率低。而FISH技术一经出现，就表现出了强大的应用前景。它应用不同放射性标记物标记的核苷酸分子制备探针，如地高辛标记脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(digoxigenin-dUTP)或生物素标记脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(biotin-dUTP)，再与不同的荧光素分子相连，通过激发荧光检测不同的探针分子，对信号进行放大，检测方便，操作简单，敏感性高，可同时应用多个探针在一张切片上对染色体进行定位，且对染色体所处的时期和形态都可不受限制。
目前，原位杂交的制片通常使用一次就丢弃了，造成了资源的巨大浪费，并且容易污染环境。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种操作简便，结果可靠的原位杂交制片多次使用的方法。
(二)技术方案本发明所述的原位杂交制片多次使用的方法，它包括以下步骤(1)用标准柠檬酸钠盐(SSC)洗涤杂交后的制片；(2)依次用70％、90％、100％的乙醇分级脱水；(3)用与前次杂交不同的一种或多种荧光素标记探针。
本发明所述的方法，当杂交的位点相同时，在SSC洗涤前，用70％的甲酰胺进行变性处理，变性处理时间为3～5分钟，经变性处理的杂交制片在标记探针时所用的荧光素可与前次杂交相同。
本发明所述的方法，其中，SSC的浓度为2×，洗涤次数为2～3次，洗涤时间为每次4～5分钟。
本发明所述的方法，其中，脱水时间为每级2～3分钟。
本发明所述的方法，其中，荧光素选自罗丹明(Rhodamine)、异硫氰酸荧光素(FITC)、生物素、地高辛中的一种或多种。
用本发明所述的方法处理后的杂交制片，再次杂交时按照常规方法操作。
(三)有益效果本发明所述的方法使得原位杂交后的制片能重复多次使用，操作简便，结果可靠，有效节约了资源，降低了成本，而且能减少对环境的污染。
图1第一次原位杂交图，图中用棉花TM-1做靶细胞，以地高辛标记的小麦45s rDNA做探针，杂交后出现红色信号，显微镜放大倍数为912×735×24；图2再次杂交图，图中用棉花TM-1做靶细胞，以生物素标记的雷蒙德gDNA做探针，杂交后出现黄色信号，显微镜放大倍数为912×735×24。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1棉花原位杂交制片多次使用实验
1.杂交后制片的处理第一次原位杂交是用棉花TM-1(国家棉花种质野生棉圃提供)做靶细胞，以地高辛(罗氏公司生产)标记的水稻45s rDNA做探针进行的，杂交结果如附图1所示。先用70％的甲酰胺进行变性处理3分钟，然后用2×SSC洗涤制片3次，每次5分钟。再依次用70％、90％、100％的乙醇分级脱水，每级3分钟。晾干备用。
2.制备探针用生物素(罗氏公司生产)标记的雷蒙德gDNA(国家棉花种质野生棉圃提供)做探针，探针浓度为5ng/ul。
3.杂交前预处理将制片置于60℃温箱中干燥过夜，用100ug/ml的RnaseA(Sigma公司生产)在37℃下温育60分钟，然后用2×SSC漂去盖片并洗涤3×5分钟；再用0.1％的Pepsin(Sigma公司生产)在37℃下处理40分钟，然后用2×SSC漂去盖片并洗涤2×5分钟；接着用4％多聚甲醛在37℃下固定10分钟，然后用2×SSC洗涤2×5分钟；最后依次用70％、90％、100％的乙醇脱水，脱水时间为每级3分钟，晾干。
4.制备杂交液杂交液总体积为20ul100％去离子甲酰胺10ul；50％硫酸葡聚糖 4ul；20×SSC 2ul；10％SDS 1ul；生物素标记的雷蒙德gDNA探针 1ul；灭菌的去离子水 2ul。
将杂交液在涡流混合器上混匀，接着置于PCR仪上在97℃变性10分钟，转入冰水中处理10分钟。
5.将20ul杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装，于85℃共变性10分钟，转入37℃水浴中杂交过夜。
6.洗脱，显微检测杂交制片先用2×SSC漂洗去盖片，再用2×SSC(含有0.1％SDS)在37℃下处理3×5分钟，然后用0.2×SSC(含有0.1％SDS)在37℃下处理3×5分钟，接着用2×SSC于室温下洗脱3次。甩干制片，加5％的BSA，加入量为50ul/片，加盖片，37℃下封阻15分钟。甩干封阻液(制片不能见干)，加Aindin-Fluo抗体(罗氏公司生产)，加入量为30ul/片，加盖片，放入37℃水浴1小时。然后用1×PBS/Teween20于37℃洗涤3×5分钟。甩干制片，加5％BSA，加入量为50ul/片，加盖片，37℃下封阻30分钟。甩干封阻液(制片不能见干)，加Anti-D抗体(罗氏公司生产)，加入量为30ul/片。用DAPI衬染10分钟。用1×PBS洗涤3×3分钟，晾干后用抗荧光衰减剂封片。最后用安装有CCD摄像头的AXiosKoP2荧光显微镜(蔡司光学仪器国际贸易有限公司生产)观察荧光信号，并用QFISH成像系统软件进行原位杂交图像的采集和加工。
杂交结果如附图2所示，采用本发明所述的方法处理后，再次杂交时能清晰的看到黄色信号。
实施例2棉花原位杂交制片多次使用实验1.杂交后制片的处理第一次原位杂交是用棉花新海7号(国家棉花种质野生棉圃提供)做靶细胞，以生物素(罗氏公司生产)标记的拟南芥18s rDNA(上海生工生物技术有限公司合成)做探针进行的。然后用2×SSC洗涤制片3次，每次5分钟。再依次用70％、90％、100％的乙醇分级脱水，每级3分钟。晾干备用。
2.制备探针用地高辛(罗氏公司生产)标记的石系亚1号(国家棉花种质野生棉圃提供)gDNA做探针，探针浓度为5ng/ul。
3.杂交前预处理将制片置于60℃温箱中干燥过夜，用100ug/ml的RnaseA(Sigma公司生产)在37℃下温育60分钟，然后用2×SSC漂去盖片并洗涤3×5分钟；再用0.1％的Pepsin(Sigma公司生产)在37℃下处理40分钟，然后用2×SSC漂去盖片并洗涤2×5分钟；接着用4％多聚甲醛在37℃下固定10分钟，然后用2×SSC洗涤2×5分钟；最后依次用70％、90％、100％的乙醇脱水，脱水时间为每级3分钟，晾干。
4.制备杂交液杂交液总体积为20ul100％去离子甲酰胺10ul；
50％硫酸葡聚糖4ul；20×SSC 2ul；10％SDS 1ul；地高辛标记的石系亚1号gDNA探针 1ul；灭菌的去离子水2ul。
将杂交液在涡流混合器上混匀，接着置于PCR仪上在97℃变性10分钟，转入冰水中处理10分钟。
5.将20ul杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装，于85℃共变性10分钟，转入37℃水浴中杂交过夜。
6.洗脱，显微检测杂交制片先用2×SSC漂洗去盖片，再用2×SSC(含有0.1％SDS)在37℃下处理3×5分钟，然后用0.2×SSC(含有0.1％SDS)在37℃下处理3×5分钟，接着用2×SSC于室温下洗脱3次。甩干制片，加5％的BSA，加入量为50ul/片，加盖片，37℃下封阻15分钟。甩干封阻液(制片不能见干)，加Aindin-Fluo(罗氏公司生产)抗体，加入量为30ul/片，加盖片，放入37℃水浴1小时。然后用1×PBS/Teween20于37℃洗涤3×5分钟。甩干制片，加5％BSA，加入量为50ul/片，加盖片，37℃下封阻30分钟。甩干封阻液(制片不能见干)，加Anti-D抗体(罗氏公司生产)，加入量为30ul/片。用DAPI衬染10分钟。用1×PBS洗涤3×3分钟，晾干后用抗荧光衰减剂封片。最后用安装有CCD摄像头的AXiosKoP2荧光显微镜(蔡司光学仪器国际贸易有限公司生产)观察荧光信号，并用QFISH成像系统软件进行原位杂交图像的采集和加工。
再次杂交后出现清晰的红色信号，不受第一次杂交的绿色信号影响。
权利要求
1.一种原位杂交制片多次使用的方法，它包括以下步骤(1)用标准柠檬酸钠盐洗涤杂交后的制片；(2)依次用70％、90％、100％的乙醇分级脱水；(3)用与前次杂交不同的一种或多种荧光素标记探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于它还包括步骤在标准柠檬酸钠盐洗涤前，用70％的甲酰胺进行变性处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的变性处理时间为3～5分钟。
4.根据权利要求1～3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述的标准柠檬酸钠盐浓度为2×，洗涤次数为2～3次，洗涤时间为每次4～5分钟。
5.根据权利要求1～3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述的脱水时间为每级2～3分钟。
6.根据权利要求1～3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述的荧光素选自罗丹明、异硫氰酸荧光素、生物素、地高辛中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供了一种原位杂交制片多次使用的方法，它包括以下步骤先用SSC洗涤杂交后的制片，再依次用70％、90％、100％的乙醇分级脱水，然后用荧光素标记探针。本发明所述的方法使得原位杂交后的制片能重复多次使用，操作简便，结果可靠，有效节约了资源，降低了成本，而且能减少对环境的污染。
文档编号G01N33/52GK1840705SQ200610011288
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者王坤波, 宋国立, 刘方, 王春英, 张香娣, 黎绍惠 申请人:中国农业科学院棉花研究所