老年性痴呆病变前期EPHA1基因的mRNA水平原位杂交筛查试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与老年性痴呆（AD)病变前期mRNA 表达改变（病理演变过程）的相关检测技术。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer' s disease-, AD)是最常见的痴呆类型，占所有痴呆 的609T80%，也是致残率高和负担大的疾病之一。到2006年，人类第一杀手心脏病死亡率 比2000年下降了 11. 5%，第二杀手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿尔茨海默病的死亡率却上 升了 47. 1%，成为老年人的第5位致死原因。随着全球性人口规模和预期寿命的增加，阿尔 茨海默病已成为世界卫生问题，根据未来的预测，痴呆患病率每二十年增加近一倍，至2030 年将达到6570万，到2050年将达到1亿1540万。各国阿尔茨海默病患者数增加不是均衡 的。发达国家的痴呆人数预测以100%的比例增长，而中国/印度及其南亚和西太平洋邻国 等发展中国家将以超过300%的比例增长，中国的AD人数则将以336%的比例增长。中国是 世界上人口老化基数最大国家，截止2008年底，我国60岁以上老年人口已接近1. 69亿，占 总人口的12%。根据2005年北京协和医院领导的一项跨省市(北京/上海/成都/西安)流 行病学调查结果估计，65岁以上老年人AD患病率为4.8%，且随着年龄增长而增加。因此， 中国绝不是一个AD低发国家，恰恰相反，而是世界上AD人数最多且增长速度最快的国家。 因此迅猛增加的疾病负担必将对我国的社会经济发展和家庭生活产生重要影响。
[0003]AD是世界上致残率高且负担重的疾病。按照2003年度世界卫生组织报导的关于 全球疾病负担的估计，60岁以上老年人中痴呆导致残疾的占11. 2%，远高于卒中（9. 5%)、骨 骼肌障碍（8. 9%)、心血管病（5%)及各种类型的癌症（2. 4%)。据美国一个跨学科专家组的共 识估计，除脊髓损伤和晚期癌症以外，AD致残加权显著高于任何其他健康状况。在美国，AD 人口已超过500万，AD的花费已超过1000亿美元，估计到2050年AD患者人数将以几何级 数方式增长到1300万人，经过核算，每年将花费1400亿美元。AD已成为重大的公共卫生 问题，并确定为未来几年公共卫生问题的研究重点。
[0004]AD是一种常见的神经系统退行性疾病，临床表现为进行性认知功能减退，典型 病理改变为老年斑（senileplaque,SP)、神经原纤维缠结（neurona1fibrillary tangles,NFT)及神经元丢失，另外伴有颗粒空泡变性（granulovacuolar degeneration,⑶)，平野小体和脑血管的改变。经过数十年有关AD的病因和发病机制的 研究后，虽然对AD的病因还有许多不了解，但是对其病理和生理机制有了肯定和全面的认 识，并从中发现了一些重要的疾病标志。现代分子遗传学在帮助人类认识AD的发病机制方 面意义非凡，发现常染色体突变能导致A0 42肽的表达增多，参与的基因包括EPHA1基因。 EPHA1基因是最近发现四个新基因与老年性痴呆发病有关其中之一。AD的生物标志物能很 好地帮助临床诊断，与病理发现有良好的一致性。2010年美国国立老化研究院和阿尔茨海 默病联合会推荐新的诊断定义与标准，强调将记忆损害与生物标志物结合。AD是疾病的整 个临床过程，包括了AD痴呆前期和痴呆期AD。AD的临床前驱期则指出现早期病理生理学 改变至出现最早的认知症状之间漫长的阶段。当前，临床使用的AD治疗药物不少，但均缺 乏有临床意义的疗效。痴呆是严重的认知功能损害，呈进展性和不可逆性，要通过药物干预 实现病情稳定或缓解是极其困难的。因此，对痴呆实施预防应该是一个重要的临床研究方 向。最新AD研究报告表明，作为"婴儿"这一代，到2050年在美国将有1千3百50万人成 为AD痴呆患者。如果，假设有一种干预可以是AD痴呆的发病延迟5-10年或提早5-10预 测和筛查，那么AD痴呆患者人数将减少80%，用于AD的预计医疗费用将会大大减少。中国 现有AD患者以超过800多万，而且，发病人数每年在上升。因此，寻找有效AD筛查工具，对 临床前期AD患者及未发生AD高危人群的早期筛查，在人群中尽早开展干预治疗，减少AD 的最终发生率有重要的临床和时代意义。尽早开发出应用于AD病变前期mRNA水平筛查试 剂盒，这将改变目前临床上的AD发生后的诊治模式，将AD的诊治提高、提前到病变前期，做 到预防性(治未病）的早期介入和治疗，并进一步做到mRNA水平的调控及基因早期治疗，将 AD消灭在萌芽状态。
[0005] 本发明人在长期研究中发现，导致老年性痴呆治疗效果不佳的主要原因是不能做 到真正的早期诊断和早期治疗。本课题拟采用核酸原位杂交技术，寻找与AD发病密切相关 的EPHA1基因一级转录功能产物-mRNA，观察其在AD病人、高危人群、正常对照人群表达变 化，统计分析其临床应用意义和价值，并培养、开发出可应用于临床的早期筛查试剂盒，用 于临床前期AD患者及高危人群的早期筛查，做到预防性诊治，尽早开展干预治疗，减少AD 的最终发生率。
[0006] 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学等研究的深入展开，为 了寻求更早期的筛查和治疗老年性痴呆、以及预防老年性痴呆，已取得长足进步。至今，我 们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断，在老年 性痴呆症的基因生理病理学演变前期，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位 杂交技术，选择多组临床标本(老年性痴呆患者、高危人群、正常对照)，对EPHA1基因与老年 性痴呆症的早期预警进行检测分析。
[0007]EPHA1基因的mRNA作为早期筛查老年性痴呆病变前期有非常重要的临床诊断意 义。EPHA1基因的mRNA在老年性痴呆症前期及病变过程中表达过度。它作于老年性痴呆病 变前期筛查、及老年性痴呆症早期预防的检测指标及治疗后的复发预警也有非常重要的临 床意义。
[0008] 发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，临床的重大疾病的临床诊治模式一 定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这 样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和 生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了大胆创新。特 别是筛选临床标本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常组织与疾病组织比较的一 贯性研发思路，来寻找和开发病变期前mRNA水平，与疾病早期基因病理生理学演变密切相 关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上疾病形成后诊治模式变成疾病的预防性诊治，争 取了疾病诊治的时间和空间，达到预防重大疾病。
[0009] 根据现有的文献资料EPHA1基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。
[0010] 本发明人在对(老年性痴呆患者、高危人群、正常对照人）例组，用原位杂交技术 进行检测，结果表明以上老年性痴呆症EPHA1基因都过度表达，高危人群有不同程度表达 15-25%，正常人都是零表达。表明EPHA1基因是老年性痴呆病变前期筛查的重要标志物。
[0011] 原位杂交技术（insituhybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化