专利名称：一种Evi-1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种Evi-l基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种Evi-l基因的原位杂交检测试 剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170 万，死亡人数近160万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800 万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人 数将翻一番，这是一组可怕的数字。
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做 了一个年度报告，"认为人类在抗癌大战中是失败"，也就是说癌症死 亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是l.肿瘤细 胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时， 该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。
本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另两个重要原因 是".不能做到真正的早期诊断；2，转移的病理机制不清楚。依照传统
的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占 位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体 征)，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这 一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，l公分的肿块约有一亿 个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿 瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病
理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的 是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已 证实 一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部 位克隆生长； 一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后 形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与 否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶， 不在我们表述的内容中)，这时己经是晚期了，这是导致癌症死亡率 不降的真正原因。
随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研 究的深入展开，至今，我们己有可能在基因水平上做更精确的早期诊 断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)时或肿瘤干细胞的存在及突 破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。
近来日本研究人员发现了导致急性白血病复发的一个基因。研究 小组从患白血病的实验鼠体内取出白血病细胞，去除Evi-l基因后再
移植到10只健康实验鼠体内；给另IO只健康实验鼠完整移植白血病
细胞(含Evi-l基因)。结果发现，前一组实验鼠比后一组实验鼠平 均晚发病一个月；而在杀灭二组实验鼠体内的白血病细胞后，前一组 实验鼠没有复发记性白血病，后一组实验鼠再次发生白血病。对照实 验已经说明，Evi-l基因对记性白血病的发生、复发有推动作用，而 这与它作用于白血病干细胞有直接关系。在临床上大约有三分之二以 上急性白血病病人经治疗后都有复发。其原因是数量极少的白血病干 细胞反复分裂、增生，使白血病细胞大量增殖。抗白血病药物虽然能 够杀灭白血病细胞，但难以杀灭其中的白血病干细胞，造成急性白血
病瘘治瘘发。日本研究人员在研究中注意到急性白血病病人体内的基
因Evi-l在造血干细胞中非常活跃，他们推测Evi-l基因可能同样作 用于白血病干细胞，使其不断分裂，导致白血病细胞大量增殖。白血 病干细胞和肿瘤干细胞一样对多种化疗都耐药，这可能是为什么目前 大多数治疗不能通过根除所有肿瘤细胞来根治肿瘤的主要原因。急性 白血病患者体内的基因Evi-1在造血干细胞中表达非常高，将它作为 白血病复发的靶标有非常重要的临床诊断意义，同时能开发出一种早 期急性白血病复发的基因诊断试剂盒，有非常重要的临床意义。
目前对Evi-l基因的研究检测技术、方法多用于科研方面，不适 应临床应用，特别是个性化的应用技术在临床上尚未发现。根据现有 的文献资料Evi-l基因的检测试剂盒及相关技术未见报道。
本发明人在对急性白血病复发患者，用原位杂交技术进行检测， 结果表明以上急性白血病复发患者Evi-l基因都过度表达。Evi-l基 因可作为白血病干细胞的检测、追踪、筛选(白血病干细胞增生、复 发)工具，可以做白血病干细胞残存的早期基因诊断的重要标志物。
中国专利文献CN1556221公开了 "IC53基因及其相关产物诊断和治疗结 肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒"。中国专利文献CN1769485公开了"梓 孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒"。中国专利文 献CN1556410公开了 "一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法"。中国专利 文献CN1680597公开了"一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR 试剂盒"。中国专利文献CN2918435，公开了 "一种检测肥胖相关基因SNP的寡 核苷酸芯片及试剂盒"。但是，关于Evi-1基因的原位杂交检测试剂盒及其检 测技术未见报道。
发明内容
本发明的目的是，提供一种Evi-l基因的原位杂交检测试剂盒在制备检 测急性白血病复发疾病药物中的应用。
本发明的再一的目的是，提供一种Evi-l基因的原位杂交检测试剂盒。 本发明的再一的目的是，提供一种Evi-l基因原位杂交检测方法。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是 一种Evi-l基因的原位杂交 检测试剂盒在制备检测急性白血病复发疾病药物中的应用，所述的试 剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1 所示，Evi-1基因的核苷酸序列长度是4873bp， CDS是114. . 3461bp， 位于染色体3q24-q28"上。
所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.l所示的RNA序列。 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 所述的放射性核素选自SH、 35S、 1251或"P中的一种。 所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶 或荧光素中的一种。
所述的非放射性标记物优选自地高辛。
其中，所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是 一种Evi-l基因的原 位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中，所述的杂交探针序 列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标 记物。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是 一种Evi-l基因原
位杂交检测方法，该方法包括以下步骤
a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；
b、 检测a步骤得到的杂交复合体。
所述a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42'C;核酸杂 交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。
本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结 合，以Evi-1基因为检测对象，合成探针是Evi-l基因的DNA或RNA 序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA'的表达 量。原位杂交技术的显示方法能提供Evi-l基因的半定量或定量表达 程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人 Evi-1基因表达低或不表达，即不显色Evi-l基因在急性白血病病人 和正常人有显著差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。本发明 的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。 本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步 骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、 结果报告，其中杂交的具体步骤包括 仪器操作
1) :将待测标本放入反应槽中；
2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3) .仪器自动弃去液体，自动后固定；
4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5) .仪器自动弃去液体，自动清洗；
6) .仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);
7) .仪器自动弃去液体，自动清洗；8) .仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10) .取出封片镜检。
本发明优点在于
1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。
2、 本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推
广。克服了目前对Evi-l基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法
多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。
3、 本发明的临床意义是更早期跟踪检测急性白血病复发的病理
演变过程，本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物， 以及影像医学检査有显著不同。本发明可以在基因水平上(急性白血
病干细胞增殖、复发早期)检测Evi-l基因异常表达，急性白血病生 化指标和细胞学检测未产生异常之前，能及早做到以上基因表达异常 的信息采集，给临床急性白血病病'患一个真正的早期复发诊断以及治 疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施的急性白血病早期诊断、 早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治急性白血病恶疾。
图1是本发明实施例中癌症病人Evi-l过量表达图片。 图2是本发明实施例中正常人Evi-l表达图片。
具体实施方式
下面结合图对本发明提供的一种Evi-l基因的原位杂交检测试剂盒及其检 测方法和应用的具体实施方式
做详细说明。
实施例1
一种Evi-1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增 效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示。杂交探针用 地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下
消化液100y 1/管l管/盒无色透明液体
保护液100u 1/管l管/盒无色透明液体
预杂交液1300 u 1/管2管/盒无色透明液体
正义杂交液10lil/管l管/盒无色透明，体
反义杂交液10ti 1/管l管/盒无色透明液体
封闭液1000 u 1/管l管/盒无色透明液体
碱性磷酸酶抗体lul/管l管/盒无色透明液体
显色剂A175u 1/管l管/盒黄色液体
显色剂B320ul/管l管/盒无色透明液体
缓冲液I 10x90ml/瓶l瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液n iox80ml/瓶l瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液m iox20m/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV 10x90ml/瓶l瓶/盒浅黄色或无色透明液体
固定液90ml/瓶l瓶/盒无色透明液体
阳性对照标本6片/盒
上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)
1、 消化液20mg/ml蛋白酶K, 100mg蛋白酶K，力n DEPC- H20 5ml;
2、 保护液0.2g的glycine加入lml的1X缓冲液I;
3、 预杂交液1X缓冲液II 7.5ml 50 XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0. 04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、 封闭液0.03g的bloking (购买自罗氏公司)加入lml IX缓冲液
III;
5、 lOx缓冲液I: (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80g
Na2HP04'12H20 3 60g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至ll,并高压灭菌；
6、 lOx缓冲液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
柠檬酸钠88. 2g HC1几滴
加三蒸水至ll,并高压灭菌；
7、 缓冲液III: (PH7.9) Tris 121. lg
NaCl 87.66g HC160ml左右
加三蒸水至U，并高压灭菌；
8、 缓冲液IV:
1M Tris-HCl(卿.5): Tirs 121. lg加HC1 3ml左右，加水900ml，调PH 至9.5，加水至ll，并高压灭菌；
1M NaCl: NaCl 58. 44加水至11，并高压灭菌；
0. 5MMgCl2: 101.65g MgCl2.6H20加水至11，并髙压灭菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1X缓冲液I至ll，稍加热(约50-60度)搅 拌至溶解；
10、 显色剂A: NBT lg加70。/。DMF11.44ml;
11、 显色剂B: BCIP lg加100%DMF30ml。 本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 实施例2
一种Evi-l基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用 一、标本处理
1、 用10ml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3 ml抗凝血缓慢 加入含有淋巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1:1.5)的离心管 中，2000r/min离心10 min;
2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1X缓冲液 I，混匀，1500g/min离心10 min;
3、 弃上清.沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I,混匀，1500g/min离心10 min;
4、 弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴 在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3 ml血，可以 做4张片子；
5、 用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X缓冲液I洗5min。 每缸可以放16片；
6、 标本可保存在-2(TC，或继续做实验。
二、 将试剂盒中试剂配制成使用浓度
1、 将10X缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1X缓冲液I ;
2、 将20 X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2 X缓冲液II;
按1:100稀释成0. 2 X缓冲液II;按1:200稀释成0. 1X缓冲液II;
3、 将IOX缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1 X缓冲液III;
4、 IOX缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV (取ltt， 2#， 3#各 10ml,加水至100ml既可)。
三、 实验步骤
1、 取每位待检者标本两张，(另外两张留作复査用)及阳性对照标本两张 (每次实验做一对阳性对照)；
2、 在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1X缓冲液199. 9ml，即为使用浓 度)20 ml。 37。C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37。C处理12 min，再用1 X缓冲液I洗5min;
3、 用0. 2%的保护液(保护液lml加1 X缓冲液199ml即为使用浓度)洗10min， 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；
4、 将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放 在42'C恒温水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%， 90%, 95%的乙醇各洗 2min ，自然干燥；
6、 将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张， 一张加正义杂交液20ul/片，
另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42t:恒温水浴 箱中16-24h;
7、 取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42*€恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min 在42。C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min 在42-C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min;
8、 用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、 将玻片放入保湿盒内，加0. 5%1封闭液(lml封闭液加5mllX缓冲液III) 100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min;
10、 取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；
11、 将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8mllX缓冲液 111)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min;
12、 取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;
13、 1X缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加 到30mllX缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；
14、 用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的1 X缓冲液I混匀)封片 镜检。
四、结果判断
在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。 阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。 所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。
癌症病人Evi-l过量表达图片见图1。正常人Evi-1表达图片见图2。 地高辛标记的cDNA、 RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优
点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等
缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫 组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断 目的基因的表达量。
本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中 的Evi-l基因表达量，用来确定急性白血病是否复发。研究表明，Evi-l基 因是白血病干细胞增殖的相关基因，因为Evi-l基因在正常人中不表达，如 果Evi-l基因表达高，说明急性白血病已复发，从而获得癌症的诊断信息。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
〈110〉芮屈生物技术(上海)有限公司
〈120〉 一种Evi-l基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
〈130〉 /
〈160〉 1
<170〉 Patervtln version 3. 1
<210> 1
〈211〉 4873
<212〉 DNA
<213〉 智人(Homo sapiens)
<400〉 1
caacatcgtg tgctgcttcg cgagaaagtc tcatagggct tcttgactaa agcccttgga tagacgaatt ttacaatgtg aagttctgca ggctcaagta cattagattc gctggctgtt taaatgatca gatattctat agagtagttg tgttcatgaa ga_gcgaagac tatccccatg ggc犯tatcg ctgcg犯gac tgtgaccagc accaaaagtt txcatgcagt actcctcact agoaaaaact cgaaagcgag aatgatctcc aatgtgacca agtttttcct gatttgcaaa aagagaggga atacaagtgt gatcagtgtc ttcgccacca gatgtcacat gacagtggaa ttttcacgga ccctagcaac cttcagcggc cccatgcatg cccggagtgt ggcaaaacgt agcacatcca cagcagtgtg aagcccttta
acattcggac cctttggcta gattgcttat 60
gcactgggtt tttcttgaag tatatgatct 120
tagatgccag tcaaccagat gttggaagct 180
atgatcagca caaccttgtt gcatgccaga 240
cagacattgc gccgggagag gagcttctgc 300
aaactatggc gccggatatc cacgaagaac 360
tctttgaatc taaggctgaa ctagcagatc 420
cagcattttc aatggttgaa gaggactttc 480
aagagataca cacgatccag gagtgtaagg 540
gcctggagaa acacatgctg tcacatactg 600
ccaaggcatt taactggaag tccaatttaa 660
agcactatga atgtgaaaac tgtgccaagg 720
acattcgctc tcagcatgtc ggtgcccggg 780
ttgccacttc gtcgggcctc aaacaacaca 840
tctgtgaggt ctgccataaa tcctatactc 900 16
agttttcaaa cctttgccgt cataagcgca tgcatgctga ttgcagaacc caaatcaagt %0
gcaaagactg tggacaaatg ttcagcacta cgtcttcctt aaataaacac aggaggtttt 1020
gtgagggcaa gaaccatttt gcggcaggtg gattttttgg ccaaggcatt tcacttcctg 謂O
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tttcttttag cttccctggt ctgtttcctt ccggcttgta ccacaggcct cctttgatac 1260
ctgctagttc tcctgttaaa ggactatcaa gtactgaaca gacaaacaaa agtcaaagtc 1320
ccctcatgac acatcctcag atactgccag ctacacagga tattttgaag gcactatcta 1380
犯cacccatc tgtaggggac aat犯gccag tggagctcca gcccgagagg tcctctg犯g 1440
agaggccctt tgagaaaatc agtgaccagt cagagagtag tgaccttgat gatgtcagta 1500
caccaagtgg cagtgacctg gaaacaacct cgggctctga tctggaaagt gacattgaaa 1560
gtg8t肌3ga g犯attt3aa gaaaal:ggtgi eia^tgttcaa agacaaagts agccctcttc 1620
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gagctttacc ttacccttcc atgtttcccc tcccattttt tccagcattc tctcaatcaa 1860
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ctatttacag agtagagaaa ag犯犯ct犯ctgaccc^ct tgaagcttta aaagagaaat 2280
acttgaggcc ttctccagga ttcttgtttc acccacaatt ccaactgcct gatcagagaa 2340
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aagaagatgc ttacttcaca gaaattcgaa atttcattgg gaacagcaac catggcagcc 2880
38tctccc3g g犯tgtggsg g3g3gaBtg3 3tggc3gtc3 ttttaasgst gaa^ggctt 2940
tggtgaccag tcaaaattca gacttgctgg atgatgaaga agttgaagat gaggtgttgt 3000
tagatgagga ggatgaagac aatgatatta ctggaaaaac aggaaaggaa ccagtgacaa 3060
gtaatttaca tgaaggaaac cctgaggatg actatgaaga aaccagtgcc ctggagatga 3120
gttgcaagac atccccagtg aggtataaag aggaagaata taaaagtgga ctttctgctc 3180
tagatcatat aaggcacttc acagatagcc tcaaaatgag gaaaatggaa gataatcaat 3240
attctgaagc tgagctgtct tcttttagta cttcccatgt gccagaggaa cttaagcagc 3300
cgttacacag aaagtccaaa tcgcaggcat atgctatgat gctgtcactg tctgacaagg 3360
agtccctcca ttctacatcc cacagttctt ccaacgtgtg gcacagtatg gccagggctg 3420
cggcgg肌tc cagtgctatc cagtccataa gccacgtatg acgttatcaa ggttgaccag 3480
agtgggacca agtccaacag tagcatggct ctttcatata ggactattta caagactgct 3540
gagcagaatg ccttataaac ctgcagggtc actcatctaa agtctagtga ccttaaactg 3600 aatg3ttt犯犯aag3aaag aaagaa犯a^
C3C3gC犯3g gC3gCtgCtg 3CttCtgg33
tg^aacaei3 33￡icttggtg ggctgaaggc ggtgggtgag犯gggcagtt gagatggcag tgaattctct tttgtacaag atcacctgac atttaatttt tttcttcgtt aaagttttat
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gaaactattt attctcgata ttttgttttg 3660
gatcaatcaa tgcgacttaa agtgattcag 3720
atcttccagt ttaccccacc ttagggtatg 3780
cattgatatg aatgaacact ccatagaaac 3840
atgattggga acagttgctt ttaattacag 3900
gtaatttaac cctttgaaga cagaagtagt 3960
aactgataac agggagtact tgttccccct 4020
agggaaaaag ggtatgtgta tattgt犯ac 4080
cagtgaagta acctattcat caccagtacc 4140
ccttgtaata acatcttaat tttagacaat 4200
gtgtgtgttg cgtgtatcat gtatttattt 4260
agcactgttc cagtcagcca ctactttatg 4320
aaggaccaag gtgacccgac ctgtgtatga 4380
cattcctttt tgtttgtttg ttttgttttc 4440
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tggaagcatg attcttctga ttaaaaactg 4560
gcttgtgcga tgttatgttc atgttaatcc 4620
tgtteaa3g3 gagaagt犯a taacagactg 4680
ccagatttgt tttctttttg tttgtaatct 4740
tttcttcaaa tgctttgtac aatataaact 4800
gagcaactaa aaaataaaga^ cttacaaa犯 4860
487权利要求
1. 一种Evi-1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测急性白血病复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序歹!j。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记 物选自放射性核素或非放射性标记物。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核 素选自3H、 35S、 1251或32P中的一种。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性 标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性 标记物优选自地高辛。
7. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8. —种Evi-l基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物， 其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
9. 一种Evi-l基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包 括以下步骤a、 将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接 触，形成杂交复合体；b、 检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形 成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间 为16 — 24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种Evi-1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种Evi-1基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测急性白血病复发疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101386888SQ200810202080
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年10月31日
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司