中国人运动优势相关基因的检测试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种中国人运动优势相关基因的检测试剂盒，所述的试剂盒包括ACE基因第16内含子的插入或缺失(I/D)多态性检测引物和ACTN3基因R577X多态性检测引物。本发明所述的试剂盒专用于检测中国人的运动优势基因，可用于为个体选择或匹配一种运动或运动项目(例如竞技项目、速度爆发力、力量型运动项目和耐力型运动项目)以及用于评价和预测运动性能、优化设计训练计划的新方法，其包括评价多个基因或基因型。本发明的试剂盒还可以用于检测幼儿、儿童和青少年的12个与运动优势和潜能相关的基因，预测其运动天赋，为其未来从事的体育运动项目提供合理化建议。
【专利说明】
中国人运动优势相关基因的检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种运动优势相关基因的检测试剂盒及其应用，特别是适用于中国人 人群的检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
[0002]
【背景技术】
[0003 ]人体运动能力的能量供应、神经肌肉控制能力及体形特征等存在着明显的种族和 个体差异，上述因素均受到基因的影响。突出的运动能力很大程度上取决于运动基因遗传 优势。随着分子遗传学的进展及其在运动医学领域的应用，科学家发现一些重要的身体运 动素质如力量、速度和耐力及其发展潜力具有相当高的遗传度，运动员对训练的敏感度也 受到遗传因素很大的影响。遗传因素作为内因，决定了人的运动天赋和发展潜力，先天影响 着发展的空间及极限。对大量优秀运动员的研究表明，先天遗传优势占2/3,后天训练所起 的作用占1/3。因此，发现与了解个人的运动遗传优势成为人们有目的的规划成长道路的重 要参考依据。
[0004] 有些人之所W能更容易取得辉煌的运动成就，目前认为，主要与W下因素有关： 1、人种的差异 国际人类基因组的正版图谱(2001年)研究表明：人与人之间的基因密码的相似程度高 达99.99%，仅0.01%的差异。但正是运0.001%的差异，使得个体在生理和体能上有了不同的 表达，使得遗传存在个体、种族间、运动能力差异。运动医学长期研究的结果表明，黑人的屯、 血管较其他人种粗，能耐高溫，脚和腿肚之间有一个出色的力矩，臀部翅起等，都是他们的 体能特点。另外，屯、肺功能、肌肉类型、力量、速度和耐力及其发展潜力具有相当高的遗传 度，运动员对训练的敏感度也在很大程度上受遗传因子的影响。
[0005] 2、运动相关基因与运动关键基因 目前与运动相关的基因有206个，起关键性作用的运动基因18个，但具体哪些运动基因 与中国人的体能指标密切相关还有待进一步研究。
[0006] 欧美国家有不少机构开展了运动基因检测服务并已应用于运动员选材过程，同时 在健康基因也开始向商业化发展，但由于人种不同，还没有针对中国人群开发的检测试剂 盒。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，为了制备得到一种针对中国人的运动优势相关基因 的检测试剂盒。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案： 本发明一方面设及中国人运动优势相关基因的检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒 包括ACE基因第16内含子的插入或缺失（I/D)多态性检测引物和ACTN3基因 R577X多态性检 测引物。
[0008] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的ACE基因第16内含子的插入或缺失（I/D) 多态性检测引物包括： 正向：5 ' -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 ' 反向：5 '-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 '。
[0009] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的ACTN3基因 R577X多态性检测引物包括： 正向：5 ' -CTG TTGCCTGTGGTAAGTGGG-3 ' 反向：5 '-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3 '。
[0010] 本发明另一方面设及上述试剂盒在检测待测对象耐力和/或爆发力中的应用。
[0011] 本发明另一方面还设及上述试剂盒在制备检测中国人耐力和/或爆发力的试剂中 的应用。
[0012] 本发明另一方面还设及一种中国人运动优势相关基因的检测方法，其特征在于包 括如下步骤： 1) 提取待测对象的外周静脉血基因组DNA; 2) 采用上述试剂盒PCR扩增ACE基因第16内含子片段； 3) 步骤2)PCR产物分析，分析待测对象的基因型，II型仅有4Wbp扩增片段，为插入纯 合型;孤型仅有19化P，为缺失纯合型；ID型既有IWbp片段，又有49化P片段，为杂合型； 4) 采用上述试剂盒PCR扩增扩增ACTN3基因的片段 5) 步骤4)PCR产物分析:采用内切酶DdeI酶切PCR扩增产物，采用琼脂糖凝胶电泳分析 酶切产物得到待测对象的基因型，RR型有20化P和86bp两条带;XX型有108bp、97bp和86bpS 条带，为纯合子突变;RX型既有20化P，又有IOSbp、97bp和86bp条带，为杂合子突变。
[0013] 本发明所述的试剂盒专用于检测中国人的运动优势基因，可用于为个体选择或匹 配一种运动或运动项目（例如短距离赛跑/力量运动或耐力运动）W及用于评价和预测 运动性能、优化设计训练计划的新方法，其包括评价多个基因或基因型。本发明的试剂盒还 可W用于检测幼儿、儿童和青少年的12个与运动优势和潜能相关的基因，预测其运动天赋， 为其未来从事的体育运动项目提供合理化建议。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0016] 实施例1: (一)研究对象 1.运动员组总共218名运动员，分别来自浙江省田径队、游泳队和皮划艇队，其中田径 运动员69名（包括2名国家级健将和2名国际级健将），游泳运动员34名，皮划艇运动员115名 (包括8名国家级健将和5名国际级健将）。根据研究需要我们将他们分成了耐力运动员组和 速度/爆发型运动员组，耐力运动员组总共129人包括8名田径运动员（> 800m)、6名游泳运 动员（含400m)和115名皮划艇运动员，速度/爆发型运动员组总共89人包括61名田径运动员 (< 400m、铅球、标枪、铁饼、跳高、跳远)和28名游泳运动员（<400m)，其中耐力运动员组男性 75人，女性54人;速度/爆发型运动员组男性43人，女性46人。
[0017] 2.对照组288名健康献血者，其中男性149人，女性139人。
[001引（二)材料、试剂与器材 1. 邸TA抗凝血:2ml/人 2. 血液基因组DNA提取试剂盒(非离屯、柱型）（北京天根生化科技有限公司） 3. PCR扩增试剂 1) PCR引物(序列见后） 2) 化姐NA聚合酶巧u/ul，北京天根生化科技有限公司） 3) dNTP(10mM)(北京天根生化科技有限公司） 4) 10XPCR Buffer(北京天根生化科技有限公司） 4. 琼脂糖凝胶电泳试剂 1) 琼脂糖(北京天根生化科技有限公司） 2) 储存液5 X T肥(Tris 54g，棚酸27.5g，抓TA45g加水定容至1000 ml，P册.0)，工作液1 X T 邸和 0.5 XTBE。
[0019] 3化样缓冲液(0.25%漠酪蓝，0.25%二甲苯氯和40%薦糖） 4)漠化乙锭(储存液浓度为lOmg/ml，工作液浓度为0.5mg/ml) 5. PCR产物柱纯化系统:含DNA吸附膜、別和…溶液。上海生工生物工程技术服务有限公 司。
[0020] 6.测序混合物:BigDye末端标记及测序混合物含有4种巧光标记dNTPs、dNTPs、DNA 聚合酶和测序酶。美国PE公司。 表1 Bi曲ye体系中的4种末端巧光标记染料 碱基染料 胶图像中 测序图中 A dR6G 绿色 绿色 C Drox 红色 蓝色 G DrllO 蓝色 黑色 T Dtamra黄色 红色 7. 蓝色葡聚糖/EDTA上样缓冲液:美国PE公司 8. DNA分子量标准 DNA Marker I和DNA Marker IK北京天根生化科技有限公司） 9. 限制性内切酶 HpyF3I(MBI F'ermen^s) 10. 主要实验仪器设备 1 )PCR仪:MG 96G型，杭州朗基科学仪器有限公司 2) 高速低溫离屯、机:Megaf Uge 1. OR型，德国Heraeus公司 3) 台式高速离屯、机:T化-16B型，上海安亭科学仪器厂 4) 电子天平:PB302型，AB54型，瑞±METTLER TOLEDO公司 5) 水平电泳槽:Tanon肥-120 Gen多功能水平电泳槽 6) 恒压恒流电泳仪:Tanon EPS300电泳仪 7) 紫外分析仪:天能2500型凝胶成像系统，上海天能 8) DK-8D型电热恒溫水槽(上海医用恒溫设备厂） 9) 縱满混匀器:华利达WH-861型 10) 微量加样器:法国Gi Ison公司 11) 冷冻冷藏设备:-80 °C深低溫冰箱(Forma Scient if iC公司） 12) 核酸蛋白测定仪:nd 1000 (美国Nano化op公司） (二)实验方法 1.人外周静脉血基因组DNA提取(试剂盒法） 1)向30化1邸TA抗凝血中加入75化1细胞裂解液化，颠倒混匀5次。
[0021] 2) 10 ,OOOXg 离屯、1 分钟。
[0022] 3)倒弃上清，将离屯、管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中。
[0023] 4)配置缓冲液FG与蛋白酶K的混合液（150iil缓冲液FG加1.化1蛋白酶K)。
[0024] 5)将混合液加入离屯、管中，立即满旋混匀至溶液无团块。
[0025] 6) 56 °C 浴1 Omin，期间颠倒混匀数次。
[00%] 7)加入异丙醇150 iil，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
[0027] 8) 1000，0 X g离屯、3分钟。倒弃上清，将离屯、管倒置在干净吸水纸上，确保沉淀在管 中。
[002引 9)加入70 %乙醇，满旋振荡5秒钟，1000,0 Xg离屯、3分钟。
[0029] 10)倒弃上清，将离屯、管倒置在干净吸水纸上停留至少5分钟，确保沉淀在管中。
[0030] 11)空气干燥DNA沉淀直至所W的液体挥发干净（至少5分钟，避免过分干燥DNA沉 淀，过于干燥的DNA很难溶解）。
[0031] 12)加入洗脱缓冲液TBl 0化1，低速满旋5秒，65 °C加热10分钟~1小时溶解DNA，期 间颠倒混匀数次助溶。
[0032] 2. DNA浓度测定及保存 用NanoDrop核酸蛋白测定仪ndlOOO测定DNA浓度，取化IDNA溶液(不需稀释巧日到上样 台即可W马上测知浓度。将已知浓度的DNA溶液稀释到25ngAU，置-20°C保存。
[0033] 3. ACE基因型检测 3.1 ACE基因第16内含子PCR扩增 3.11引物设计： PCR扩增ACE基因第16内含子片段，PCR引物序列如下： 正向：5 ' -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 ' 反向：5 '-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 ' 3.12 PCR反应 1) 反应体系： DNA模板 2山巧Ong) IOXBuffer 3 山 25mM MgC12 3 山 IOmM dNTPs 1 山 IOpmol上游引物0.8山 IOpmol下游引物0.8山 hq DNA聚合酶 2 U 加去离子水至 30山 2) PCR循环条件:反应混合物经94 °C预变性5分钟后，W94°C变性60秒，58 °C退火120秒， 72°C延伸90秒，共35个循环后，最后72°C延伸5分钟终止扩增，PCR扩增采用朗基MG 96G型 PCR 仪。
[0034] 3 )PCR产物分析:取PCR扩增产物扣1，加入化1上样缓冲液，室溫下于2 %琼脂糖凝 胶恒压120V电泳20-40分钟，EB染色15分钟，然后置紫外分析仪上检测PCR扩增产物及其特 异性，对扩增不理想者重新扩增。人群中有3种基因型：II型仅有490bp扩增片段，为插入纯 合型;孤型仅有19化P，为缺失纯合型；ID型既有IWbp片段，又有49化P片段，为杂合型。
[0035] 4. ACTN3基因型检测 4.1 ACTN3基因的PCR扩增 4.11引物设计： PCR扩增ACTN3基因的片段，PCR引物序列如下： 正向：5 ' -CTG TTGCCTGTGGTAAGTGGG-3 ' 反向：5 '-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3 ' 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0036] 4.12 PCR反应 1) 反应体系：。
[0037] DNA模板 2 yK50ng) IOXBuffer 3 山 25mM MgCb 3 IOmM dNTPs I 山 IOpmol上游引物0.6山 IOpmol下游引物0.6山 Taq DNA聚合酶2 U 加去离子水至30山 2) PCR循环条件:反应混合物经94°C预变性5分钟后，W94°C变性30秒，58.2°C退火30 秒，72°C延伸45秒，共35个循环后，最后72°C延伸5分钟终止扩增，PCR扩增采用朗基MG 96G 型PCR仪。
[003引3 )PCR产物分析:取PCR扩增产物扣1，加入化1上样缓冲液，室溫下于2 %琼脂糖凝 胶恒压120V电泳20-40分钟，EB染色15分钟，然后置紫外分析仪上检测PCR扩增产物及其特 异性，对扩增不理想者重新扩增。
[0039] 4.2限制性酶切 4.21酶切反应体系： PCR产物 10山 去离子水 16山 IOXBuffer Tango 2 山 内切酶DdeKlOU/山）1山 总共 29山 加完需充分混匀 4.22酶切反应溫度和时间： 在37°C恒溫水浴箱中作用2~3小时，放入65°C恒溫水浴箱20min终止反应。
[0040] 4.23酶切产物检测： 采用琼脂糖凝胶电泳。取酶切产物10山，与化1 6 X上样缓冲液混合上样，于3.5%琼脂 糖凝胶、0.5 X T邸缓冲液中水平电泳，IOOV约1小时，邸染色15分钟，然后置紫外分析仪上检 测酶切产物。人群中有3中基因型:RR型有20化P和86bp两条带;XX型有108bp、97bp和86bpS 条带，为纯合子突变;RX型既有20化P，又有IOSbp、97bp和86bp条带，为杂合子突变。
[0041] 5. DNA序列测定 5.1 PCR产物的纯化:采用PCR产物胶回收柱纯化系统。
[0042] 1)用1%低烙点琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，尽可能薄地切割含目的片段的 凝胶，置1.5ml离屯、管中； 2) 加 Sl液及1/3体积异丙醇，混匀，56°C水浴10分钟充分溶解； 3) 移液至含DNA吸附膜的纯化柱，12000rpm离屯、1分钟，用Wl液离屯、洗涂两次； 4) 加去离子水溶解吸附膜上DNA 30分钟，12000巧m离屯、2分钟收集DNA溶解液。取化1上 样，1%琼脂糖凝胶电泳，WDNA分子量标准(天根DNA Marker II)为参照，检测纯化片段的 大小、纯度及浓度。
[0043] 5.2测序反应 1) 反应总体积为20山，其中含： 纯化的DNA模版150~300 ng 3.2pmol单侧测序引物1山 测序反应混合物(Mix) 8山 加去离子水至20山 2) 循环反应条件:在朗基MG 96G型PCR仪上进行循环测序反应:96°C 10秒，50°C 5秒， 60°C 4分钟，25个循环后，4°C保存。
[0044] 5.3测序反应产物的纯化： 1) 20山测序反应产物，加入76 %乙醇80山，充分混匀，短暂离屯、，室溫下避光静置20分 钟。
[0045] 2) 12，000巧m离屯、20分钟后，小屯、吸除上清； 3) 加入70%乙醇250山，充分混匀，12 ,OOOrpm离屯、10分钟后，小屯、吸除上清； 4) 打开离屯、管盖，PCR仪上90°C干燥2分钟； 5) 加入化1测序变性上样缓冲液，96 °C变性3分钟，立即放入冰浴。
[0046] 5.4 则序电泳:在ABI377自动测序仪上进行： 1)在DNA Sequencer软件中设定样品栏，运行"化eck-plate"程序检测电泳玻璃板清洁 度/'Pre-run程序"（1.68KV)进行预电泳至玻板溫度达56°C。
[0047] 2)在预电泳模式下上样化1。
[004引 3)运行"Run"程序进行电泳（1.68KV，9小时），软件自动收集信号，电泳结束后用 DNA Sequencer软件结合手动调节，对每个电泳道的信息进行逐道跟踪分析，得出相应样品 碱基序列，打印彩色波形图谱。
[0049] 6.序列比较分析 WGeneBank[www.n;Lbc .nlm.nih.gov]中人ACTN3基因（基因登录号NM_001104)序列为 正常标准，所得序列用DNA TooKVer. 5.1)或PC GE肥(Ver3.0)软件进行序列对比，确定突 变的位置和性质。
[0化日]7.统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，等位基因和基因型频率分布经基因平衡定律 a.不同类型运动员组ACE基因型分布特征 位于ACE基因第16号内含子的插入或缺失(I/D)多态性经PCR方法检测可W扩增出两种 DNA片段，一种是49化P长的DNA片段，称之为插入型（I型），另一种是IWbp长的DNA片段，称 之为缺失型(D型），因此在群体中可有II、ID及DD巧巾基因型，II型仅有49化P片段，为插入 型纯合子;孤型仅有IWbp片段，为缺失型纯合子；ID型则既有490bp片段，又有IWbp片段， 为杂合型。
[0051] 表1耐力运动员组与爆发型运动员组ACE基因型男女分组比较
注：O中的值表示该基因型占总数的百分比。
[0052] 从上述研究结果看来女性耐力运动员II基因型频率较对照高，孤基因型频率较对 照低，即中国女性耐力运动员ACE基因多态频率分布特征。另外，对照人群ACE基因 I/D多态 频率分布与欧美人群有非常显著差异，即在汉族普通人群高比例的I等位基因和II基因型 频率的基础上，欧美研究结论中得出的杰出耐力运动员的独特特征或许不可能出现在汉族 群体中，或许是另外的表现形式。
[0053] (3) b.不同类型运动员组ACTN3基因型分布特征 PCR扩增出长29化P的DNA片段，由于人类ACTN3基因 R577X多态性，从测序结果可W判断 ACTN3基因第16号外显子的1747核巧酸是否有一 C到T位点突变，如果无突变发生，则为RR纯 合野生型，若该位点变为T，则为XX突变纯合型，若既有C又有T则为RX杂合型。如果为RR型， 扩增出来的片段只有一个DdeI酶切位点，若带有1747C到T突变，则会产生一个新的DdeI酶 切位点，3种ACTN3基因型PCR扩增片段经DdeI限制性内切酶消化后可见，纯合子突变XX型经 酶切后能产生巧巾长度片段，分别为86bp、97bp和IOSbp，RR型只有86bp和20化P两种片段，RX 型既有86bp和20化P片段，又有97bp和IOSbp片段，为杂合型。
[0化4] 爆发型运动员组ACTN3基因型分布特征 131例对照人群中ACTN3基因型分布为RR型36.6%(48/131)，RX型为48.9%(64/131)，XX 型为14.5%(19/131);等位基因频率R型为61.1%，X型为38.9%。89名爆发型运动员ACTN3基因 型分布为 RR 型 34.8%(31/89)，RX 型为 49.4%(44/89)，XX 型为 15.8%(14/89);等位基因频率 R 型为59.6%，X型为40.4%。见表巧口 3 表2爆发型运动员组ACTN3基因型分布
[005
注：O中的值表示该基因型占总数的百分比。
[0056] 由上述结果可知，女性耐力运动员XX基因型所占比例和X等位基因频率均显著高 于对照组，由此可见，ACTN3基因的X等位基因对女性耐力运动员的耐力表现有促进作用。
[0057] W上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可W作出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 中国人运动优势相关基因的检测试剂盒，其特征在于，包括ACE基因第16内含子的插 入或缺失（Ι/D)多态性检测引物和ACTN3基因 R577X多态性检测引物。2. 根据权利要求1所述的中国人运动优势相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述的 ACE基因第16内含子的插入或缺失（Ι/D)多态性检测引物包括： 正向：5 ' -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 ' 反向：5 '-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 '。3. 根据权利要求1所述的中国人运动优势相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述的 ACTN3基因 R577X多态性检测引物包括： 正向：5 ' -CTG TTGCCTGTGGTAAGTGGG-3 ' 反向：5 '-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3 '。4. 上述试剂盒在检测待测对象耐力和/或爆发力中的应用，待测对象为女性。5. 上述试剂盒在制备检测中国人耐力和/或爆发力的试剂中的应用，待测对象为女性。6. -种中国人运动优势相关基因的检测方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 提取待测对象的外周静脉血基因组DNA; 2) 采用上述试剂盒PCR扩增ACE基因第16内含子片段； 3) 步骤2)PCR产物分析，分析待测对象的基因型，II型仅有490bp扩增片段，为插入纯 合型;DD型仅有190bp，为缺失纯合型；ID型既有190bp片段，又有490bp片段，为杂合型； 4) 采用上述试剂盒PCR扩增ACTN3基因的片段； 5) 步骤4)PCR产物分析:采用内切酶Ddd酶切PCR扩增产物，采用琼脂糖凝胶电泳分析 酶切产物得到待测对象的基因型，RR型有205bp和86bp两条带;XX型有108bp、97bp和86bp三 条带，为纯合子突变;RX型既有205bp，又有108bp、97bp和86bp条带，为杂合子突变； 优选的，所述待测对象为女性。
【文档编号】C12Q1/68GK105861731SQ201610419880
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】韦俊芳
【申请人】杭州势必健生物科技有限公司