NRAS基因突变检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因NRAS基因突变检测试剂盒。
背景技术：
：NRAS基因是RAS癌基因家族的成员，定位于1号染色体，基因全长85kb，哺乳动物RAS基因家族包括c-Hras1、c-K-ras2及N-ras基因。ras基因家族编码含188-189个氨基酸残基，分子量为21KD的蛋白即P21蛋白，其氨基酸序列高度保守，仅有C末端40个氨基酸的差异。RAS蛋白具有GTP/GDP结合的能力及GTP酶活性，它们的正常功能为G蛋白类似的调节蛋白，具有从膜结合受体到腺苷酸环化过程的信号传导作用，参与细胞周期的正常调控。RAS基因活化主要是通过（1）编码区内的点突变；（2）插入激活；突变激活RAS基因家族主要是以点突变为主。突变的RAS蛋白失去内在的GTP酶活性使ras蛋白维持于活化状态，不断激活靶分子，引起信号传导的持续效应，导致细胞大量增殖，从而发生恶性转化。目前研究表明，N-ras基因突变在ras基因突变中出现的频率最高，以第12、13、61或146密码子突变最为常见，其常见突变位点有Codon12:G12A,G12C,G12D,G12R,G12S,G12V；Codon13:G13A,G13C,G13D,G13R,G13S,G13V；Codon61:Q61E,Q61H,Q61K,Q61L,Q61P,Q61R；Condon146：A146K。N-ras突变主要发生于骨髓增生异常综合症（MDS)、黑色素瘤、肝癌、急性髓系白血病（AML）等。国外研究发现RAS基因突变在MDS检出率可达20%-50%不等，ras基因突变与MDS预后的关系密切相关，这种预后关系现在研究倾向与该基因突变与MDS进展为AML密切相关，基因突变导致基因组的不稳定，导致预后差及生存期短。PaduaRA,GuinnBA10等通过对75名MDS患者进行10年随访研究发现ras基因突变率为36%，携带ras基因突变者向急性白血病转化的风险较阴性者显著提高。FernandezT等采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交技术分析了巴西人群50例MDS患者发现21例患者存在N-ras基因点突变（42%），其中9例发展为急性白血病，对N-ras基因点突变和染色体异常相关性分析发现8号染色体三体可能和N-ras基因点突变相关，这部分病人在随访过程中均进展为急性髓系白血病。FenauxP等认为10%的MDS患者在诊断初即可表现为N-ras基因突变阳性，30%-40%的患者随着疾病进展出现N-ras基因突变。N-ras基因在恶性黑色素瘤中的突变率为13%-25%，NRAS基因与黑色素瘤细胞增殖的相关性，随着黑色素瘤细胞的增殖，细胞内NRASmRNA和蛋白表达量均显著提高。研究证明携带N-ras或V600BRAF基因突变的晚期黑色素瘤患者可以从BRAF抑制剂治疗中获益。然而，对于BRAF野生型肿瘤患者（包括携带NRAS变异基因的患者）来说就不存在靶向治疗。意大利国立肿瘤研究机构的PaoloAAscierto等针对上述问题进行了相关研究，他们的Ⅱ期临床试验研究发现，对于N-ras基因变异的黑色素瘤患者，一种小分子MEK1/2抑制剂——MEK162是第一个有效的靶向治疗药物，且可能为几乎无有效治疗方法的癌症患者提供一种新的治疗选择。NRAS基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测NRAS基因的技术具有重要的临床意义。技术实现要素：本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种NRAS基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中NRAS基因主要突变位点型别，检测位点包括NRAS基因2、3和4三个外显子的主要突变位点，包括但不限于2号外显子上c.34G>A，p.G12S突变位点；3号外显子上c.181C>A，p.Q61K突变位点；4号外显子上c.436G>A，p.A146T突变位点。本发明的NRAS基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中NRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，具体序列如下:（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对NRAS基因2、3和4三个外显子进行测序分析，具体序列如下：外显子名称序列号Reverse5’-3’2SEQ-N2SEQIDNo.7TAGATGTGGCTCGCCAATTAAC3SEQ-N3SEQIDNo.8TGCATTCCCTGTGGTTTTTAAT4SEQ-N4SEQIDNo.9CCCAGCCTAATCTTGTTTTTCT（3）3个装有NRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒分别是2号外显子上c.34G>A，p.G12S突变位点；3号外显子上c.181C>A，p.Q61K突变位点；4号外显子c.436G>A，p.A146T突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl21.525mMdNTPs0.4H2O10.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主是根据NRAS基因2、3和4三个外显子的保守序列分别设计NRAS基因三个外显子的特异性引物，分别将Exon2、3和4三个外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从NRAS基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计NRAS基因2、3和4三个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNOs：1-9。长度在20-25个碱基左右（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因NRAS基因2、3和4三个外显子片段回收用于测序。附图说明以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。图1为NRAS基因的Exon2、3和4三个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图1中各标号的具体表示如下：2：NRAS基因第2号外显子；3：NRAS基因第3号外显子；4：NRAS基因第4号外显子；M：DNAmaker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。图2-1为NRAS基因的Exon2外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-2为NRAS基因的Exon2外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-3为NRAS基因的Exon3外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-4为NRAS基因的Exon3外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-5为NRAS基因的Exon4外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-6为NRAS基因的Exon4外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。具体实施方式1、引物设计根据NRAS基因在结直肠癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从NRAS基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计NRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQIDNos：1-6。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNos：7-9。长度在20-25个碱基。2、PCR扩增2.1、质控品准备阳性质控品为NRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。2.2、试剂配制提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。确定反应数N，N=待检样本数（n）×3+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：组分PCRmix3（即PCR反应预混液）Taq酶体积（μl）19.75×N0.25×N取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。2.3、加样将NRAS阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加1.25μl，同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。2.4、PCR扩增配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。回收得到的产物即可用于测序。序列表<110>广州凯普医药科技有限公司<120>NRAS基因突变检测试剂盒<160>9<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx2-F<400>1tagatgtggctcgccaattaac22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx2-R<400>2gaatatgggtaaagatgatccgac24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx3-F<400>3tgcattccctgtggtttttaat22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx3-R<400>4cctttcagagaaaataatgctcct24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx4-F<400>5cccagcctaatcttgtttttct22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx4-R<400>6cacaaatgctgaaagctgtacc22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N2<400>7tagatgtggctcgccaattaac22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N3<400>8tgcattccctgtggtttttaat22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N4<400>9cccagcctaatcttgtttttct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