一种遗传性耳聋基因检测试剂盒的制作方法
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋基因检测试剂盒。
背景技术：
目前市场上已有的耳聋基因检测产品主要有博奥的九项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)和十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)；凯普的耳聋易感基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)；中生北控的四项耳聋基因检测试剂盒(ARMS-PCR法)；济南英盛的先天性耳聋基因检测试剂盒(荧光PCR法)、药物性耳聋基因检测试剂盒(荧光PCR法)、耳聋基因GJB2 235delC检测试剂盒(荧光PCR法)和PDS基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)；智海生物工程有限公司的药物性耳聋基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)。尽管目前检测耳聋的产品有很多，但是尚未有直接、快速、同时检测多个突变位点的产品。
厦门大学相关专利《一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用》(专利公开号104263848A)是所有专利中检测位点最多的，但也仅检测23种非综合征遗传性耳聋基因突变位点，无锡中德美联生物技术有限公司相关专利《一种遗传性耳聋基因检测试剂盒》(专利公开号103352080A)仅检测17种非综合征遗传性耳聋易感基因突变，陈瑛《中国人群耳聋基因筛查试剂盒及其应用》(专利公开号103911452A)检测17种非综合征遗传性耳聋易感基因突变，北京科聆金仪生物技术有限公司《一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用》(专利公开号102534031A)检测12种聋病易感基因突变，这些检测试剂盒检测能力有限，或者通量低、或者耗时费力，更重要的是难以同时对不同基因的多个突变位点进行高通量检测。本公司相关专利为《一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒》(专利开号104498609A)和现在本公司申请发明专利不属于同一个技术平台。
目前我国临床应用的检测非综合征遗传性耳聋基因的试剂盒主要是基于液相芯片杂交法的原理开发的，实现在多管PCR体系中对多个基因中为数不多的突变位点进行检测，如博奥生物技术有限公司、潮州凯普生物化学有限公司的十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒和耳聋易感基因检测试剂盒能分别实现对15种和9种耳聋易感基因突变位点的检测，但是这些方法或者所需专用仪器价格高、或者通量低、或者操作复杂耗时费力。
除了上述的基于液相芯片杂交法的试剂盒，临床上还有一种是基于荧光PCR技术的原理开发，如中生北控和济南英盛生物技术有限公司开发的试剂盒仅能实现对耳聋易感基因的少数几个位点进行检测，特别是济南英盛的每个试剂盒只能对一个基因的少数几个位点进行检测、检测位点少、通量低、如需同时对一个样本的几个耳聋易感基因进行检测，需要同时使用三个试剂盒、成本高。
目前国内还没有针对中国人群多个耳聋易感基因的多个突变位点进行检测的试剂盒。因此，有必要建立一种高通量、高效能、低成本的耳聋基因突变筛查方法，已实现临床快速检测或者规模化人群筛查。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种可一次同时检测与遗传性耳聋相关的四个热点基因中的30个突变位点的遗传性耳聋基因检测试剂盒。
本发明提供一种遗传性耳聋基因检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR反应液A、PCR反应液B、PCR反应液C、PCR反应液D和PCR反应液E；
所述PCR反应液A包括如下引物和探针：
引物G2F1：5'-TAGTGATTCCTGTGTTGTGTG-3'；
引物G2R1：5'-AGCCTTCGATGCGGACCTTCTG-3'；
内参引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；
内参引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；
探针P1：5'-GTTTGTTCACACCCCCCAGGA-Z4-BHQ1
探针P2：5'-CAGCCACAATGAGGATC-3'；
探针P3：5'-TGCAGACAAAGTCGGCCT-3'；
探针P4：5'-TAGCACACGTTCTTGCAGCCTGGCTGCAG-3'；
探针P5：5'-CAGCTGCAGGGCCCATAG-3'；
探针P6：5'-CTTCTCGTCTCCGGTAGGC-Z4-3'；
探针P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；
所述PCR反应液B包括如下引物和探针：
引物G2F2：5'-GACCTACACAAGCAGCATC-3'；
引物G2R2：5'-TTCAGCAGGATGCAAATTCCAGACAC-3'；
引物G3F1：5'-AGTTCCTCTTCCTCTACCTG-3'；
引物G3R1：5'-CACAGATGGTGAGTACGATGCAGACG-3'；
引物SF1：5'-AAATACCGAGTCAAGGAATG-3'；
引物SR1：5'-GCCTTGAAGGGTAAGCAACCATCTGTC-3'；
引物SF2：5'-GAACACTTTCTCGTATCCAGCAGC-3'；
引物SR2：5'-TCCATCTATATTTTACTTGTAAGTTC-3'；
引物SF3：5'-CACAGCTAAAGATTGTCCTC-3'；
引物SR3：5'-CCATCCCTGGAGCAAGAAGCAACAC-3'；
内参引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；
内参引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；探针P7：5'-AGGCGTTCGTTGCACTTCACCA-3'；
探针P8：5'-CTTCTTGGTAGGTCGGGCAAT-3'；
探针P9：5'-TAGCCCAATACTAACTCCCG-3'；
探针P10：5'-CCTGACTCTGCTGGTTGGAAT-Z4-3'；
探针P11：5'-GATAATAGGGAGAACTCCATTGT-3'；
探针P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；所述PCR反应液C包括如下引物和探针：
引物SF4：5'-CTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTG-3'；
引物SR4：5'-GTACTAAGAGGAACACCACAC-3'；
引物SF5：5'-TCATCCAGTCTCTTCCTTAG-3'；
引物SR5：5'-AGCCTTCCTCTGTTGCCATTCCTC-3'；
引物SF6：5'-GAGCAATGCGGGTTCTTTGACGAC-3'；
引物SR6：5'-TCTTGAGATTTCACTTGGTTC-3'；
内参引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；
内参引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；探针P12：5'-TTTGTTTTATTTCAGACGAT-3'；
探针P13：5'-CCTGAGAAGATGTTGCTGAT-3'；
探针P14：5'-GCCGTGCGGGAAAGAGCAGTG-3'；
探针P15：5'-TTTGATGGTCCATGATGC-Z4-3'；
探针P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；
所述PCR反应液D包括如下引物和探针：
引物SF7：5'-AGATTCTTAGATTTTCCAGTCC-3'；
引物SR7：5'-AGAGGGTCTAGGGCCTATTCCTGATTG-3'；
引物SF8：5'-GTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCC-3'；
引物SR8：5'-ATACTGGACAACCCACATC-3'；
引物MF1：5'-CGCGGTCACACGATTAACCCAAGTC-3'；
引物MR1：5'-TGTTAAGCTACACTCTGGTTC-3'；
内参引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；
内参引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；
探针P16：5'-ATAAAATACTTACTGTGGACTT-3'；
探针P17：5'-TCCATAGCCTTCTGCTTGACTGTG-Z4-3'；
探针P18：5'-GAGATCACAGCGGGTGGTAAG-3'；
探针P19：5'-ATCACCCCCTCCCCAATA-3'；
探针P20：5'-CCACTATGCTTAGCCCTA-3'；
探针P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；
所述PCR反应液E包括如下引物和探针：
引物MF1：5'-CGCGGTCACACGATTAACCCAAGTC-3'；
引物MR1：5'-TGTTAAGCTACACTCTGGTTC-3'；
引物MF2：5'-AGGCTCATTCATTTCTCTAAC-3'；
引物MR2：5'-CATGGGGTTGGCTTGAAACCAGC-3'；
引物MF3：5'-CCACAACACAATGGGGCTCACTCAC-3'；
引物MR3：5'-AGGGTGGTTATAGTAGTGTG-3'；
内参引物GF1：5'-CTATGACTTAGTTGCGTTAC-3'；
内参引物GR1：5'-GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3'；
探针P21：5'-ACCGCCCGTCACCCTCCTCAA-3'；
探针P22：5'-TAGAGGAGACAAGTCGTAACAT-3'；
探针P23：5'-TTTGCCTAGATTTTATGTATACG-3'；
探针P24：5'-CGACCCCTTATTTACCGA-Z4-3'；
探针P25：5'-CGCTCCAACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3'；
其中，探针序列中包含Z4的探针代表此探针为ZNATM探针，碱基下方设有下划线的为锁核酸修饰的碱基。
优选的，上述的遗传性耳聋基因检测试剂盒中，所述探针的5’设有荧光基团，3’设有淬灭基团，所述的荧光基团为FAM、TET、CY5、HEX或ROX中的一种；所述的淬灭基团为能与荧光基团配套的BHQ1、BHQ2或BHQ3基团中的一种。
优选的，上述的遗传性耳聋基因检测试剂盒中，所述PCR反应液包括：MgCl2、PCR Buffer、dNTP混合物、Taq酶和UNG酶。
本发明有益效果在于：本发明试剂盒可一次同时检测与遗传性耳聋相关的四个热点基因中的30个突变位点，其能快速、稳定的对上述各个位点基因型进行诊断。使用本发明的检测试剂盒，能更全面和更早发现携带耳聋基因的患儿，特别是迟发性听力缺陷患儿，降低市面上已有常见耳聋基因检测试剂盒造成的基因缺陷漏检率，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地降低聋哑发病率，同时该产品也可以应用于产前基因诊断并以此为依据，通过人为干预可以避免新生聋人的增加。
本发明试剂盒利用文献报道的各种突变位点的序列设计特异扩增的LATE-PCR专用引物，以应用多重不对称PCR对多种基因型进行同管检测(共五管)，采用锁核酸修饰的ZNATM探针，对SNP的区分能力更强，荧光背景低并且能完全区分同一管反应液中同一荧光标记的两条探针，使最少管的反应液检测最多的位点。本发明设计的引物和探针的组合，可一次实验检测与遗传性耳聋相关的四个热点基因中的30个突变位点且试剂盒中的PCR反应液A、B、C、D、E可使用同一扩增程序在同一台荧光PCR仪上进行测试，满足临床快速、方便检测耳聋的需求。
附图说明
图1为本发明具体实施方式实施例1中的ZNATM探针的结构示意图；
图2a为本发明具体实施方式实施例1中的使用ZNATM探针的熔解曲线结果图；
图2b为本发明具体实施方式实施例1中的使用ZNATM探针的熔解曲线结果图；
图3为本发明具体实施方式实施例1中的ZNATM探针的作用机理图；
图4为本发明具体实施方式实施例1中的锁核酸结构示意图；
图5为本发明具体实施方式的实施例2中使用遗传性耳聋基因检测试剂盒检测得到的熔解曲线结果图；
图6为本发明具体实施方式的实施例2中使用遗传性耳聋基因检测试剂盒检测得到的熔解曲线结果图；
图7为本发明具体实施方式的实施例2中使用遗传性耳聋基因检测试剂盒检测得到的熔解曲线结果图；
图8为本发明具体实施方式的实施例2中使用遗传性耳聋基因检测试剂盒检测得到的熔解曲线结果图；
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
本发明最关键的构思在于：可一次实验检测与遗传性耳聋相关的四个热点基因中的30个突变位点，且试剂盒中的PCR反应液A、B、C、D、E可使用同一扩增程序在同一台荧光PCR仪上进行测试，满足临床快速、方便检测耳聋的需求。
实施例1
本发明试剂盒可一次同时检测与遗传性耳聋相关的四个热点基因中的30个突变位点即GJB2(35delG、109G>A、155delTCTG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、512insAACG)、GJB3(538C>T、547G>A)、SLC26A4(281C>T、589G>A、749T>C、754T>C、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、IVS15+5G>A、2162C>T、2168A>G)、mtDNA(961T>G、1095T>C、1494C>T、1555A>G、7444G>A、7445A>G、12201T>C)。
1、引物的设计及筛选
先利用文献报道的各种突变位点的序列设计特异扩增的LATE-PCR专用引物，以应用多重不对称PCR对多种基因型进行同管检测为目的(共五管)，通过随机组合不同引物，优化退火温度梯度，最终选择一批特异性好的引物，能满足临床快速、方便检测耳聋的需求。
这里的LATE-PCR是不对称PCR(asymmetric PCR)的高级形式。要求两条引物的Tm值之间至少要相差5℃上，其中这里的Tm值是指经过浓度修正后的Tm值，低浓度引物即限制性引物的TmL值要比高浓度引物即非限制性引物的TmX值要高，从而保证在指数扩增阶段，即在较高的退火温度下，这里的较高退火温度要尽量低于TmL从而保证限制性引物的有效使用，同时要足够高于TmX来减少由高浓度的非限制性引物带来的干扰，使这一阶段的扩增具有更高的扩增效率，同时减少非特异扩增，得到更多可用于下一步模板的双链DNA；在线性扩增期时使用比较低的更适合非限制性引物的退火温度，从而提高了这一阶段的扩增效率，这一阶段的扩增效率是由非限制性引物(TmX)和扩增子(TmA)的退火温度决定，TmA和TmX不能相差太大，TmA－TmX≤15℃。各个突变位点的扩增引物优选组合序列见表1。
表1耳聋各基因型检测引物序列
2、探针的设计及筛选
2.1 ZNATM探针
ZNATM探针是由一段寡核苷酸序列连接了一段重复的阳离子精胺单元组成，结构如图1所示。这里的阳离子精胺单元可以根据需要连接多个。ZNATM探针的优点是可以提高探针的Tm值同时可以降低荧光背景信号，因为连接的这段阳离子精胺单元是带有正电荷的，而靶标核苷酸由于含有磷酸骨架而带负电荷，带有正电荷的阳离子精胺单元可以减少其与靶标DNA之间的“静电排斥”作用，使探针与靶标DNA结合得更牢固，从而提高了探针的Tm值；ZNATM探针具有更低的荧光背景信号可能是因为寡聚阳离子这一端会向阴性寡核苷酸链方向折叠，缩短了由于探针内部的静电排斥作用形成的两末端距离即荧光基团和淬灭基团之间的距离，这样荧光基团所发出的荧光就能完全被淬灭基团所吸收。
在SNP基因分型时发现探针越短，其区分能力越强，但是随着长度的变短，探针的Tm值就会降低，使探针在循环过程中的结合效率降低。在运用多色探针熔解曲线分析时发现，如果一个荧光通道检测两条探针，那么在双杂合子的情况下，是应该有四个熔解峰出现即有四个Tm值，但是在实验过程中发现，在很多情况下，都存在Tm值的交叉，造成无法判读结果。因此，我们在同一管使用同一种荧光标记的两条探针时，其中一条使用ZNATM探针，这样就能完全区分四个Tm值，如图2表示的是同一个检测通道的两条检测探针，图2a中的两条探针都没有采用ZNATM探针，发现中间的两个峰Tm值只相差2.5℃，在检测临床样本时由于Tm值会有一个波动范围，因此，会造成这两个峰的重叠，不利于结果的判读；而图2b的其中一条探针是采用ZNATM探针，发现黄色那条探针的Tm值整体都提高了，可以和另外一条探针的熔解峰完全区分开。
ZNATM探针的作用原理如图3所示：在没有靶序列存在的条件下，ZNATM探针自由卷曲，这时由于荧光基团和淬灭基团离得比较近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团所吸收，此时只能检测到微弱的荧光信号；当反应体系中有互补的靶序列存在时，在整个熔解曲线过程中，低温时ZNATM探针与靶序列杂交，形成刚性和稳定的双链结构杂交体，荧光基团和淬灭基团的距离比较远，这时荧光基团所发出的荧光不能被淬灭基团所吸收，因而可以检测到很强的荧光信号；随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降，荧光变化最强的点对应的温度即是探针与靶序列形成双链结构的熔点(Tm)。ZNATM探针与不同的靶序列杂交形成的双链结构的稳定性不同，因而具有不同的熔点，从熔点的差异就可以判断靶序列的差异。
2.2锁核酸修饰探针
锁核酸是一种双环状核酸衍生物，核糖的2’-O位和4’-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，锁核酸的具体结构见图4。锁核酸具有序列特异性，它比常规的核酸能更好地区分正确配对和错误配对序列，含有错配碱基的LNA-DNA杂交分子比含有错配碱基的DNA-DNA杂交分子更加不稳定，在LNA-DNA双螺旋中的一个错配碱基至少使Tm值下降20℃，而在相应的DNA-DNA双螺旋中，一个错配碱基使Tm值下降4-l6℃。本发明采用锁核酸对那些野生和突变型区分能力弱的探针进行修饰，有的直接对检测位点进行修饰，有的是对检测位点及相邻的碱基进行修饰，从而达到对单碱基错配的识别能力。
表2为本发明遗传性耳聋各位点的检测探针序列，其中包含Z4的代表此探针为ZNATM探针，碱基下方设有下划线的为锁核酸修饰的碱基。
表2
3.引物浓度、探针浓度以及反应体系其他组分确定
本发明遗传性耳聋基因检测试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR反应液A、PCR反应液B、PCR反应液C、PCR反应液D和PCR反应液E；其中的引物及探针为上述1、2两点所述序列，引物及探针储存液的浓度范围在0.1～1μmol/L，MgCl2终浓度选择1.5mM-9mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合液dNTP终浓度选择100nM-300nM，脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)终浓度选择100nM-300nM，DNA聚合酶终浓度选择1-7.5U/反应，利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见表3PCR反应液A配方、表4PCR反应液B配方、表5PCR反应液C配方、表6PCR反应液D配方和表7PCR反应液E配方。
表3
表4
表5
表6
表7
注：DNA加样量为3μL，总反应体积为25μL。
引物、探针的筛选和体系优化是本发明的重点，由于反应体系A、B、C、D、E都是多重不对称PCR且还包含了多条探针，多重PCR容易产生各扩增片段的相互抑制，而且部分基因GC含量高、同源性高且二级结构复杂，导致扩增不稳定，而探针之间及探针与引物之间如果形成复杂的二级结构也会影响后续熔解曲线的结果，直接造成没有熔解峰出现。经过大量摸索实验，才优化出上述的五个反应体系。
3.PCR反应条件的确定
本发明遗传性耳聋基因检测试剂盒采用两段式PCR体系。反应条件分以下步骤优化：
经过大量实验对比优化，反应液A、B、C、D、E可使用同一扩增程序在同一台荧光PCR仪上进行测试，最佳反应条件为：
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增条带，导致假阳性结果；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到对所有基因型无非特异性扩增，特异性好，扩增效率高，灵敏度高。
4、本发明遗传性耳聋基因检测试剂盒用于非综合征遗传性耳聋基因型的检测过程依次包括如下步骤：
(1)提取待检测样品DNA：从外周血提取基因组DNA，浓度在5～200ng。
(2)荧光PCR扩增：以提取的基因组DNA为模板进行荧光PCR扩增，获得熔解曲线结果。
(3)结果判读：根据多色探针熔解曲线结果即待检样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm差值的变化判读待检样本是否含有相应基因突变，以及基因突变类型。标准对照是野生型质粒，可用于校正外部条件造成的实验误差。结果判读步骤为：首先，读取各检测通道中标准对照的Tm值；其次，读取待检样本在各检测通道的Tm值；最后，将待检样本在各检测通道中的Tm值减去标准对照在各检测通道对应的Tm值，得到各检测通道的ΔTm值，参照表10判断待检样本是否存在突变及突变的类型。
5、本发明试剂盒的有益效果
1)本发明采用多重LATE-PCR技术结合多色荧光探针熔解曲线技术可同时检测GJB2基因上8种突变、GJB3基因上2种突变、SLC26A4基因上13种突变及mtDNA基因上7种突变。与现有的检测耳聋基因突变的同类专利相比，本发明增加了155delTCTG、512insAACG、281C>T、589G>A、1095T>C及12201T>C的检测，155delTCTG与512insAACG突变会引起先天性中重度感音神经性耳聋，281C>T与589G>A会引起大前庭水管综合征和先天或后天中重度感音神经性耳聋，1095T>C及12201T>C会引起母系遗传迟发性耳聋，若不进行检测有可能会导致漏检，增加耳聋患儿的出生概率，给家庭和社会带来严重的负担。现有检测耳聋的同类专利，均不能实现以上30种耳聋基因突变的检测。使用本发明试剂盒，可以一次试验就完成与遗传性耳聋相关的四个热点基因中30种突变的检测，大大节约了成本和节省了时间；
2)简便快速、可同时检测多个基因突变位点、耗时短：本发明的用于检测耳聋基因突变的试剂盒可在五管PCR反应液中完成与遗传性耳聋相关的四个基因上的30种突变检测，通过简单的加样上机，整个操作只需2.5～3h即可完成，操作步骤少、耗时短；
3)检测通量高：本发明所采用的多色探针熔解曲线方法主要分为两部分，一是PCR扩增，二是熔解曲线分析，因此，这两部分即可同时在荧光PCR仪上完成，也可以在普通PCR仪上进行扩增，然后在荧光PCR仪上进行熔解曲线分析，通过一台荧光PCR仪配合多台普通PCR仪进行检测，可大大提高检测通量；
4)特异性好、检测结果准确：本发明所采用的锁核酸修饰的ZNATM探针，对SNP的区分能力更强，荧光背景低并且能完全区分同一管反应液中同一荧光标记的两条探针，使最少管的反应液检测最多的位点。
5)均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，添加模板后PCR扩增和熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的几率。
实施例2
本发明遗传性耳聋基因检测试剂盒采用LATE-PCR和多色荧光探针PCR熔解曲线技术。在需要检测的突变区域设计相应的探针，并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物PCR扩增含有待检测区域的片段，PCR扩增结束后进行熔解曲线分析。将待检样本在各检测通道中的Tm值减去标准对照在各检测通道对应的Tm值，得到各检测通道的ΔTm值，根据这个ΔTm值来判断待检样本是否存在突变及突变的类型。
1、本发明遗传性耳聋基因检测试剂盒主要组成如表8，其中的引物与探针为实施例1中对应的序列限定。
表8
2、适用仪器
本发明试剂盒适用于带有FAM、HEX、ROX和CY5检测通道且具有熔解曲线分析功能的实时PCR扩增仪，型号为Bio-Rad CFX96和Roche LightCycler480Ⅱ。
3、储存条件及有效期
试剂盒置于-18℃以下避光保存，有效期为6个月。
试剂盒需低温保存运输，在途时限不宜超过5天。
试剂盒在37℃保存不宜超过5天。
试剂盒反复冻融不宜超过10次。
试剂盒开瓶后-18℃以下储存，在效期内性能稳定。
生产批号、生产日期、失效日期：见标签。
4、样本要求
1)适用样本：本试剂盒样本来源为外周抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。
2)样本采集：抽取静脉血5mL放入含有抗凝剂的管中，标记好样本的姓名和编号等样本信息。
3)血样保存：抗凝全血在室温(15～25℃)放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一个月，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。
4)血样运输：抗凝全血运输时需用泡沫箱加冰袋密封，且在途时限不宜超过72小时。
5、检验方法
1)DNA的提取：推荐使用亚能公司的“核酸提取试剂”提取人基因组DNA。PCR扩增前，可采用核酸定量仪或紫外分光光度计对模板DNA浓度和纯度进行测定。本试剂盒要求待检基因组DNA的浓度为5～200ng/μL，纯度(A260/A280)为1.7～2.1。
2)反应液准备：从试剂盒中取出所有组分置于室温融化并震荡混匀，于5000rpm短暂离心。
各管反应液的需求量＝待检样本数N+1个野生型对照+1个阴性对照。
用微量加样器向八联管或者96孔板中的每个孔加入22μL的反应液。
3)加样
用微量加样器分别向每个孔加入3μL的待检样本、野生型对照和阴性对照，盖紧管盖，5000rpm短暂离心。
4)PCR扩增
扩增程序如表9。
表9
6、参考值(参考范围)
野生型对照在各体系及各通道中的熔点(Tm)值范围详见下表10。
表10
7、检验结果的解释
通过比较待检样本在A、B、C、D和E体系中共20个检测通道与野生型对照之间熔点(ΔTm值)的差异判断样本是否发生突变。当样本熔解峰与野生型对照熔解峰差异(ΔTm值)在±1℃以内的即为野生型峰，差异超过±2℃的即为突变型峰，详情见附表11、12和13，其为检测的突变类型及各突变类型在对应通道的ΔTm值，具体情况如下：
(1)若待检样本20个检测通道只有野生型峰出现，则样本为野生型。
(2)若待检样本在某个通道既有野生型峰又有突变型峰，而其他通道为野生型峰，则样本为该种突变的杂合型，通过计算对应野生型与突变型峰熔点的差异(ΔTm值)，判断其突变的类型。
(3)若待检样本在某个通道只有一个突变型峰，而其他通道为野生型峰，则样本为该种突变的纯合型，通过计算对应野生型与突变型峰熔点的差异(ΔTm值)，判断其突变的类型。
(4)若样本在两个通道有两个突变型峰，而其它通道为野生型峰，则样本为这两种突变的双杂合型，通过计算对应野生型与突变型峰熔点的差异(ΔTm值)，判断其突变的类型。
表11
表12
表13
8、检验方法的局限性
该试剂盒采用的是探针荧光熔解曲线法，该方法可以检测探针覆盖范围的序列变异，故可能检测到除本试剂盒30个位点外的突变。
由于线粒体突变属于异质性突变，其存在不同程度的突变水平(0-100％)。应通过与对应野生型峰的形状进行区分辨别，对于线粒体的7个检测位点，其检测限为20％以上。
9、注意事项
(1)试剂盒必须严格按照所要求的保存条件保存，各组分使用前请充分融化、混匀并短暂离心后再开盖使用，以保证反应体系体积完整及防止潜在的污染。
(2)请严格分区操作实验，各区物品均为与用，实验室环境污染、试剂污染、样本交叉污染可能导致假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配置不准确可能会引起试剂检测效能下降、出现假阴性或检测不准确的结果。
(3)为保证实验结果准确性，请务必在扩增前测定DNA浓度和纯度，确保样本符合本试剂的检测要求后再进行后续实验。
(4)本试剂盒适用样本为外周枸橼酸钠戒EDTA抗凝全血，若使用其他类型的样本，出现检测结果差异与本试剂盒质量无关。
(5)反应液配置、分装及加样的操作过程中应尽量避光，加样后尽快盖紧管盖并短暂离心。
(6)每次实验应进行质量控制。
(7)检测样本应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求。
(8)实验中使用的吸头请直接打入盛有消毒剂的废液缸内，并与其他废弃物一同灭菌后方可丢弃。
(9)本试剂盒仅用于体外诊断。
10、使用本发明遗传性耳聋基因检测试剂盒检测样本的结果
图5为本发明试剂盒反应体系E中ROX通道的熔解曲线结果图，其中标准对照是代表野生型峰，另外一个峰代表是突变型峰，所以这个待测样本是1494杂合型；
图6为本发明试剂盒反应体系C中CY5通道的熔解曲线结果图，其中标准对照是代表野生型峰，另外一个峰代表是突变型峰，所以这个待测样本是1174纯合突变型；
图7为本发明试剂盒反应体系A中FAM通道的熔解曲线结果图，其中标准对照1是代表109G>A野生型峰，标准对照2代表35delG野生型峰，待测样本1代表109G>A突变型峰，待检样本2代表的是35delG突变型峰，所以待测样本1是109纯合突变型，待测样本2是35delG纯合突变型；
图8为本发明试剂盒反应体系C中ROX通道的熔解曲线结果图，其中标准对照是代表野生型峰，待测样本1代表的是1226G>A突变型峰，待测样本2代表的是1229C>T突变型峰，待测样本3即有野生型峰又有1226G>A突变型峰，所以是1226G>A杂合突变型，待测样本4既有野生型峰又有1229C>T突变型峰，所以是1229C>T杂合突变型。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 亚能生物技术（深圳）有限公司
<120> 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
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