专利名称：一种检测肿瘤相关基因的方法
技术领域：
本发明属生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种检测肿瘤相关基因的方法。
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本发明通过对肿瘤患者如肺癌患者血浆中分离纯化DNA，用PCR方法进行检测其中P16基因表达的改变，为临床预测和预后分析提供参考资料。
本发明方法通过下述方法和步骤进行，1)取肿瘤患者血浆标本肝素抗凝，离心后，血浆保存备用；2)分离纯化提取血浆DNA；取备用血浆直接加等量生理盐水，重复加入Tris-饱和酚和氯仿∶异戊醇混合液，混匀、分层后，离心，取上层液；再加入氯仿∶异戊醇混合液，混匀、分层后，离心取上层液，加冷无水乙醇和乙酸钠(pH5.2)混匀，冰箱过夜。次日离心，弃上清，加乙醇洗涤，离心弃上清，自然干燥，干燥管内加双蒸水溶解沉淀DNA，用核酸测定仪定量DNA，并计算吸光度A260/A280的比值。
3)PCR方法检测P16外显子2基因表达。
P16外显子2基因的引物序列为5`--TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense)，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense)，取样本DNA，Taq酶，PCR反应仪(P.E.-TC1.美国公司生产)进行反应，反应条件94-95℃变性3-5分钟；按94-95℃45-60秒、55-60℃45-60秒、72℃1分钟，40-45个循环后，72℃延伸5-10分钟。同时用β-actin基因作内参照，其引物序列为5``--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(Sense)，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(Antisense)。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，图象分析。
本发明方法特异性高，能为临床预测和预后分析提供参考资料，并且操作简单，成本低，可在一般实验室开展。
其中，M是100bp DNA Ladder Marker(Promega公司)，4、6、8为P16外显子2基因缺失肺癌患者血浆标本，1-3，5-7为P16外显子2基因表达肺癌患者血浆标本。
分离纯化提取血浆DNA 取出备用血浆，室温融化，加入等量生理盐水，分管1ml/每管。分别加入Tris-饱和酚250ul和250ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀至乳白色，置4℃30分钟待分层后，在4℃离心仪上，以12000rpm离心15分钟，吸取上层液放入新管；再加入Tris-饱和酚250ul和250ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀至乳白色，置4℃30分钟待分层后，在4℃离心仪上，以12000rpm离心15分钟，吸取上层液放入新管；再加入500ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀至乳白色，置4℃20分钟待分层后，在4℃离心仪上，以12000rpm离心15分钟，吸取上层液放入新管；每管400ul分别加入1ml冷无水乙醇和200ul3M乙酸钠(pH5.2)混匀，置-20℃冰箱过夜。次日在4℃离心仪上，以12000rpm离心15分钟，弃去上清液，加入75％乙醇1ml洗涤，在4℃离心仪上，以12000rpm离心15分钟，弃去上清液，用纸吸干管口液体后，在超净工作台上风机自然干燥。干燥的管内分别加入双蒸水溶解沉淀DNA，应用eppendrof核酸测定仪定量DNA，并计算吸光度A260/A280的比值。
PCR方法检测P16外显子2基因PCR反应总体积为25ul，反应体系为10×PCR buffer2.5ul，内含15mM氯化镁，dNTPs其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mM，P16外显子2基因的引物序列为5`--TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense)，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense)，浓度均为50pMol.各取1ul，样本DNA量为1ug左右，Taq酶2单位，加双蒸水至25ul。石蜡油20ul封盖液体。在PCR反应仪(P.E.-TC1.美国公司生产)上，94℃变性5分钟后；按94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟，40个循环；72℃延伸10分钟。同时用β-actin基因作内参照，其引物序列为5`--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(Sense)，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(Antisense)。PCR扩增产物采用1.6％琼脂糖凝胶(含EB)电泳，以电压100V，电泳30分钟。在GIS图象分析系统上，分析PCR扩增条带，以promega公司生产的PCR标准品为对照，P16外显子2基因为400bp，β-actin基因为318bp。
本发明方法检测结果表明，在58例肺癌患者血浆中分离纯化DNA含量为374.0±307.2ug/ml，浓度范围36.0～1491.0ug/ml。吸光度A260/A280的比值为0.93±0.11，其比值范围0.71～1.17。在58例肺癌患者血浆中β-actin基因表达率为100％(58/58)。P16基因的表达率为43.1％(25/58)。其中肺腺癌的表达率为21.7％(5/23)，肺鳞癌为61.5％(16/26)，腺鳞癌混合型为44.4％(4/9)。按分期，其中I期肺癌患者血浆中P16基因的表达率为30％(6/20)，II期患者的表达率为54.5％(6/11)，III期的表达率为47.8％(11/23)，IV期为25％(1/4)。在对照组10例心脏科患者血浆中β-actin基因表达率为90％(9/10)。P16基因的表达率为90％(9/10)。经统计学分析，肺癌患者血浆中P16基因的表达率明显低于对照组心脏科患者(P＜0.05)。
结果证实本发明方法可利用肿瘤患者的血浆或血清中分子信息抑癌基因P16外显子2表达的变化，判断肿瘤患者治疗效果及复发转移。
权利要求
1.一种检测肿瘤相关基因的方法，其特征是采用PCR方法检测血浆DNA中P16基因表达。
2.按权利要求1所述的检测肿瘤相关基因的方法，其特征是所述的血浆是肿瘤患者血浆。
3.按权利要求1和2所述的检测肿瘤相关基因的方法，其特征是通过下述步骤进行，1)取肿瘤患者血浆标本肝素抗凝，离心后，血浆保存备用；2)分离纯化提取血浆DNA；3)PCR方法检测P16外显子2基因表达
4.按权利要求3所述的检测肿瘤相关基因的方法，其特征是所述的分离纯化提取血浆DNA中，取备用血浆直接加等量生理盐水，重复加Tris-饱和酚和氯仿∶异戊醇混合液后，再加氯仿∶异戊醇混合液后，加冷无水乙醇和乙酸钠pH5.2。
5.按权利要求3所述的检测肿瘤相关基因的方法，其特征是所述的P16外显子2基因的引物序列为5`--TGGCTCTGACCATTCTGT，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG，内参照β-actin基因引物序列为5`--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA。
6.按权利要求3所述的检测肿瘤相关基因的方法，其特征是所述的PCR反应条件为94-95℃变性3-5分钟，按94-95℃45-60秒、55-60℃45-60秒、72℃1分钟，40-45个循环后，72℃延伸5-10分钟。
7.按权利要求3所述的检测肿瘤相关基因的方法，其特征是所述的PCR反应条件为94℃变性5分钟，按94℃60秒、55℃60秒、72℃1分钟，40个循环后，72℃延伸10分钟。
全文摘要
本发明属生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种检测肿瘤相关基因的方法。本发明通过对肿瘤患者血浆中分离纯化DNA，用PCR方法检测其中P16基因表达的改变。本发明方法特异性高，可判断肿瘤患者治疗效果及复发转移，能为临床预测和预后分析提供参考资料，并且操作简单，成本低，可在一般实验室开展。
文档编号C12Q1/68GK1439724SQ0311595
公开日2003年9月3日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者包国良, 董强刚 申请人:上海市胸科医院