牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及动物生物【技术领域】中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒。一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有PCR反应液，CAPN3*B和CAPN3*C的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L?EDTA?pH8.0。本发明的优点是本发明对牦牛的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
【专利说明】牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物生物【技术领域】中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛肉嫩度候选基因等位基因检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]钙蛋白酶(Calpain，CAPN)是一类存在于脊椎动物细胞质中的钙依赖性半胱氨酸中性蛋白水解酶，与钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)和钙蛋白酶激活蛋白(CalpainActivator)构成依赖于钙离子的蛋白水解酶系统,对动物宰后肌肉成熟嫩化有重要作用。哺乳动物已发现16种钙蛋白酶，其中CAPN1、2、4、5、7、10、13、14、15和16在动物组织中广泛表达，而CAPN3、6、8、9、11和12为组织特异性钙蛋白酶。
[0003]普通牛CAPN3基因位于第10号染色体，瘤牛及普通牛CAPN3基因SNPs与肉嫩度相关性存在一定差异，草原红牛及日本和牛(天一岗山黑牛)CAPN3基因与大理石花纹及嫩度等肉质性状相关。
[0004]牦牛是青藏高原及其周边高寒牧区的特产家畜，也是当地牧民重要的生产和生活资源。目前CAPN3已成为肉嫩度候选基因而被国内外广泛研究，并在分子遗传育种标记方面加以应用。牦牛肉嫩度相关基因分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测牦牛的CAPN3基因第2内含子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的牦牛个体肉嫩度强弱，从而判断是否可以留作种用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低用于牦牛肉嫩度候选基因分子选种技术。`
[0006]本发明的又一目的在于提供一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法。
[0007]通过PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体CAPN3基因第2内含子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合肉质嫩度相关的生产数据，确定嫩度较强的等位基因，为改善牦牛肉嫩度提供指导。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于包括有:
[0009]引物序列为:
[0010]CAPN3-F:5’CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ ；
[0011]CAPN3-R:5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’。
[0012]一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，CAPN3*B和CAPN3*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED,12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1 ；
[0013]所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0 ；
[0014]所述的PCR反应液:总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2.0 μ L，Mg2+浓度为 2.5mM, dNTPs 的终浓度为 100 μ M，引物 CAPN3_F:5’ CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ 和 CAPN3-R: 5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U,，ddH20 补充体积至20 μ L0
[0015]所述的CAPN3*B的DNA标准样的核苷酸序列为:
[0016]
cagaglclcc aggacaclca cacaccccac tcagcaagac aaaagccctg Ulclagcag 60
gacccacctl cct lagaggg cttcccltgl gaclcagtgg Iiaagaglil gccigccagi120
gcaggagatg ggagtttgat ccctgggtca ggaagagtcc ctggagaagg aaatggctac 180
ccactccagc gUctigcci ggiaaaatcc catggacaga ggagcctggc aggctaagtc 240
[0017]
catgggglca cgaggaglca gacalgacll agagactaaa caacaacctt ccllagaagg 300
cagctctgaa attgtg316
[0018]所述的CAPN3*C的DNA标准样的核苷酸序列为:
[0019]·
cagagtctcc aggacactca cacaccccac tcagcaagac aaaagccctg tltctagcag60
gacccacclt cctiagaggg cltcccilgi gaclcagtgg ilaagagiii gcctgccagt120
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catgggglca cgaggagtca gacalgacll tgagaclaaa caacaaccii ccllagaagg300
cagclclgaa atlgtg316
[0020]所述的牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为:
[0021](I)待检牦牛基因组DNAl μ L/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件:预变性940C 5min，变性 94°C 30s，退火 62°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 个循环，最后延伸 72°C IOmin进行扩增；
[0022](2)用步骤(1)中扩增的PCR产物和CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
[0023](3)步骤(2)中检测到的带型与CAPN3*B或CAPN3*C标准样带型一致的样品为携带控制牦牛肉嫩度等位基因的个体。
[0024]一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于检测步骤为:
[0025](I)样品采集:牦牛颈静脉采血10ml，A⑶抗凝，_20°C冻存；
[0026](2)基因组DNA的提取:用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA ；
[0027]( 3)聚合酶链式反应:[0028]PCR反应体系:总体积20 μ L，其中10 X buffer缓冲液为2.0 μ L，Mg2+浓度为
2.5mM, dNTPs 的终浓度为 100 μ M，引物 CAPN3-F 和 CAPN3-R 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U,模板DNA50ng，ddH20补充体积至20 μ L ;反应条件:预变性94°C 5min,变性94°C 30s,退火62°C 30s,延伸72°C 30s，共35个循环，最后延伸72°C IOmin ；
[0029]引物序列为:
[0030]CAPN3-F:5’CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ ；
[0031 ] CAPN3-R:5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’ ；
[0032](4 ) PCR 产物的 SSCP 检测:
[0033]取2 μ I的PCR产物加入8 μ I的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA ρΗ8.0，98°C变性 lOmin，立即冰浴 IOmin ；12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，10°C电泳18h，银染法显色后拍照；
[0034](5)结果判断:
[0035]对牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有3个等位基因，控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸和CAPN3*C核苷酸序列；对牦牛肉嫩度无影响的为CAPN3*A 核苷酸序列；CAPN3*B 的核苷酸序列为:cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaatggctacccactccagcgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg ；
[0036]CAPN3*C 核音酸序列为:cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaatggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg ；
[0037]对耗牛肉嫩度无影响的CAPN3*A核苷酸序列为:cagagtctccaggacactcacacaccccactcAgcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtgo
[0038]本发明的有益效果:反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型牦牛养殖企业的肉质嫩度的改良。
[0039]本发明利用PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体CAPN3基因第2内含子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合肉质嫩度相关的生产数据，确定嫩度较强的等位基因，为改善牦牛肉嫩度提供指导。本发明通过对试验牦牛CAPN3基因第2内含子的SSCP分析，发现了 3个(A、B、C)等位基因。其中，A等位基因对牦牛肉嫩度影响不显著。
[0040]本发明对牦牛肉嫩度的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
【专利附图】
【附图说明】:[0041]图1是牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测凝胶图。
【具体实施方式】
[0042]以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面以甘南牦牛肉嫩度分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。
[0043]实施例1:一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于包括有:
[0044]引物序列为:
[0045]CAPN3-F:5’CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ ；
[0046]CAPN3-R:5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’。
[0047]实施例2: —种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，CAPN3*B和CAPN3*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED, 12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1 ；
[0048]所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯青，10mmol /T, EDTA pH8.0 ；
[0049]所述的PCR反应液:总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2.0 μ L，Mg2+浓度为 2.5mM, dNTPs 的终浓度为 100 μ M，引物 CAPN3_F:5’ CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ 和 CAPN3-R:5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, ddH20 补充体积至20 μ L0`[0050]所述的CAPN3*B的DNA标准样的核苷酸序列为:
[0051]
【权利要求】
1.一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其特征在于包括有: 引物序列为:
CAPN3-F:5’ CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ ；
CAPN3-R:5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’。
2.一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于包括有PCR反应液，CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样；，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED, 12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1 ； 所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯青，IOmmoI/L EDTA pH8.0 ； 所述的PCR反应液:总体积20yL，其中IOXbuffer缓冲液为2.0 μ L，Mg2+浓度为2.5mM, dNTPs 的终浓度为 100 μ M，引物 CAPN3-F: 5’ CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ 和 CAPN3-R: 5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’ 各 0.1 μ M，Taq聚合酶 0.5U, ddH20补充体积至 20 μ L。
3.如权利要求2所述的牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为: (1)待检牦牛基因组DNAlμ L/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件:预变性94°C 5min，变性94°C 30s，退火62°C 30s，延伸72°C 30s，共35个循环，最后延伸72°C IOmin进行扩增； (2)用步骤(1)中扩增的PCR产物和CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测； (3)步骤(2)中检测到 的带型与CAPN3*B或CAPN3*C标准样带型一致的样品为携带控制牦牛肉嫩度等位基因的个体。
4.一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为: (1)样品采集:牦牛颈静脉采血10ml，A⑶抗凝，-20°C冻存； (2)基因组DNA的提取:用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA； (3)聚合酶链式反应: PCR反应体系:总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2.0 μ L, Mg2+浓度为2.5mM,dNTPs的终浓度为100 μ M，引物CAPN3-F和CAPN3-R各0.1 μ M，Taq聚合酶0.5U,模板DNA50ng，ddH20补充体积至20 μ L ;反应条件:预变性94°C 5min，变性94°C 30s，退火62°C 30s,延伸72°C 30s，共35个循环，最后延伸72°C IOmin ； 引物序列为:
CAPN3-F:5’ CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3’ ；
CAPN3-R:5’ CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3’。 (4)PCR产物的SSCP检测: 取2 μ I的PCR产物加入8 μ I的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA ρΗ8.0，98°C变性 lOmin，立即冰浴 IOmin ；12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，10°C电泳18h，银染法显色后拍照； (5)结果判断: 对牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有3个等位基因，控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸和CAPN3*C核苷酸序列；对牦牛肉嫩度无影响的为CAPN3*A核苷酸序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103866002SQ201410024220
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】胡江, 罗玉柱, 刘秀, 李少斌, 潘红梅 申请人:甘肃农业大学