一种马恶性高热病的基因检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，具体涉及一种马恶性高热病的基因检测试剂盒。

背景技术：

马恶性高热病(Equine malignant hyperthermia,EMH)是一种由卤化麻醉剂、去极化肌肉松弛剂和应激等引起的骨骼肌紊乱，马恶性高热病与兰尼定受体1的突变相关，是兰尼定受体1基因(GenBank登录号AY375484)在外显子46发生的单碱基错义突变(C7360G)引起的基酸替换R2454G进而引起的疾病。

目前未见马恶性高热病的成熟高效的商用检测试剂盒的报道。对于点突变引起的单基因遗传病的检测技术来说，涉及到DNA测序或芯片的技术都比较贵，涉及到荧光、生物素、磁珠的技术也都成本较高。现有技术中存在着快速，简单，高效，低成本地检测马恶性高热病的需求。这对农牧业生产具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的不足，本实用新型提供一种马恶性高热病的基因检测试剂盒，用于方便、快速、低成本地检测马恶性高热病兰尼定受体1基因的单碱基错义突变C7360G。本实用新型是通过以下技术方案实现的：

本实用新型提供的一种马恶性高热病的基因检测试剂盒，包括包装盒体，包装盒体内设有含有用于盛放正向引物的试剂瓶，用于盛放反向引物的试剂瓶和用于盛放突变型正向引物的试剂瓶。

包装盒体是任何可以容纳并保存试剂瓶的装置或容器。

包装盒体可以是方便容纳试剂瓶的任何形状，其可以是长方体、正方体、球状或椭球状，其水平截面可以是多边形，圆形，椭圆形或花瓣形。

包装盒体可以是木质的、纸质的、塑料的、陶瓷的或金属的。

包装盒体的盒盖与盒本体可以是一体成型的，可选地，是纸盒或塑料盒，盒盖与盒体依靠纸板或塑料板的可折叠性支持开闭。

包装盒体的盒盖与盒本体可以通过转轴连接。

包装盒体是透明的、半透明的或不透明的。

包装盒体关闭状态可以是气密的和/或防水的。

包装盒体内侧壁和/或底壁可贴有防震动缓冲层，可选地，该缓冲层是一层海绵或橡胶。

各个试剂瓶相同或不同。

任一试剂瓶可以是透明的、半透明的或不透明的；

任一试剂瓶可以是带有可插拔的橡胶塞或软木塞的玻璃、塑料或金属试管；

任一试剂瓶可以是瓶与瓶盖配合的容器，其中瓶盖是塞入瓶的，或瓶盖是靠旋转拧在瓶上的。

任一试剂瓶可以是安剖瓶、青霉素瓶。

任一试剂瓶表面有可以写字的标签。

正向引物序列为：5’-ATCTAATCCAAGCCGGC。

反向引物序列为：5’-CAGAGGGAGGCTGATGA。

突变型正向引物序列为：5’-CCGAAGCTCTGAGGATCC。

可选地，包装盒体内设有盛放野生型反向引物的试剂瓶。

野生型反向引物序列为：5’-CGAGCGCAGGATGGCGCC

可选地，包装盒体内设有盛放双链DNA参照序列的试剂瓶。

放双链DNA参照序列长度为70bp。

可选地，包装盒体内设有盛放内参照序列的正向引物的试剂瓶和盛放内参照序列的反向引物的试剂瓶。

内参照序列的正向引物为：5’-GCTCACTCTCCTCTCCC。

内参照序列的反向引物为：5’-GAAGTGGGGGAAGTAGG。

或者：

内参照序列的正向引物为：5’-TCAAGGAGCAGCTCAA。

内参照序列的反向引物为：5’-GCAGAGGCGATTGCCG。

可选地，包装盒体内还设有用于PCR反应的试剂瓶组。

其中，试剂瓶组9包括：用于盛放PCR缓冲液的试剂瓶、用于盛放MgCl₂的试剂瓶、用于盛放dNTPs的试剂瓶、用于盛放Taq酶的试剂瓶、用于盛放超纯水的试剂瓶。

可选地，包装盒体内还设有用于DNA电泳的试剂瓶组。

其中，用于DNA电泳的试剂瓶组包括：用于盛放琼脂糖的试剂瓶。用于盛放TBE缓冲液的试剂瓶。

可选地，包装盒体内还设有保温隔层。

保温隔层是任何可以延缓包装盒体内外热交换的结构。

可选地，保温隔层是泡沫材料制成的。

可选地，保温隔层是双层不锈钢结构。

可选地，保温隔层是双层玻璃结构。

可选地，保温隔层与包装盒体是一体成型的。

可选地，包装盒体内还设有储冷剂包。

可选地，储冷剂包是内置冰块的塑料袋子。

可选地，包装盒体内还设有样品收集试剂瓶。

样品收集试剂瓶可以与其他试剂瓶相同或不相同。

样品收集试剂瓶内可装有生理盐水、含有肝素的生理盐水或含有青霉素的生理盐水。

可选地，包装盒体内还设有试剂盒使用说明书。

本实用新型的有益效果主要有：该试剂盒架构简单，操作方便，通过选择试剂盒中的试剂瓶并配合常规的PCR仪与电泳仪及其必要的耗材与试剂，可以简单、快速、低成本地应用于马恶心高热病的基因检测，包括对突变型的检测以及鉴别检测。通过简单地通过肉眼观察电泳图谱，就可以判断所测试马的该病的基因型。另一个效果是，本试剂盒测试的电泳图谱中，不同的目标扩增条带之间的干扰降到很低，对检测目的来说，可以认为不存在这种干扰。

附图说明

图1为实施例1的结构示意图。

图2为实施例1的测试原理示意图。

图3为实施例2的测试原理示意图。

具体实施方式

为了更直观更清楚地描述本实用新型技术方案，以及帮助理解本实用新型对现有技术的贡献之处，以下结合附图和实施例对本实用新型进行详细地说明。

实施例1

图1为本实用新型提供的一种马恶性高热病的基因检测试剂盒的结构示意图，包括包装盒体1，包装盒体1内设有含有用于盛放正向引物的试剂瓶2，用于盛放反向引物的试剂瓶3和用于盛放突变型正向引物的试剂瓶4。

包装盒体1是任何可以容纳并保存试剂瓶的装置或容器。

包装盒体1可以是方便容纳试剂瓶的任何形状，其可以是长方体、正方体、球状或椭球状，其水平截面可以是多边形，圆形，椭圆形或花瓣形。

包装盒体1可以是木质的、纸质的、塑料的、陶瓷的或金属的。

包装盒体1的盒盖与盒本体可以是一体成型的，可选地，是纸盒或塑料盒，盒盖与盒体依靠纸板或塑料板的可折叠性支持开闭。

包装盒体1的盒盖与盒本体可以通过转轴连接。

包装盒体1是透明的、半透明的或不透明的。

包装盒体1关闭状态可以是气密的和/或防水的。

包装盒体1内侧壁和/或底壁可贴有防震动缓冲层，可选地，该缓冲层是一层海绵或橡胶。

各个试剂瓶相同或不同。

任一试剂瓶可以是透明的、半透明的或不透明的；

任一试剂瓶可以是带有可插拔的橡胶塞或软木塞的玻璃、塑料或金属试管；

任一试剂瓶可以是瓶与瓶盖配合的容器，其中瓶盖是塞入瓶的，或瓶盖是靠旋转拧在瓶上的。

任一试剂瓶可以是安剖瓶、青霉素瓶。

任一试剂瓶表面有可以写字的标签。

该试剂盒的测试步骤的原理如下：

步骤1：采集血清等包含全基因组的生物材料；

步骤2：采取任何常规的技术手段提取样本的基因组DNA；

步骤3：参照图2的示意图，对所用引物做如下设计：其中，平行线代表待检测的基因组的一部分，粗线代表正义链，细线代表反义链，三角形所在O点代表待检测是否突变的位点。以O点上游A点为起点设计正向引物p1(盛放于试剂瓶2)；以O点下游B点为起点设计反向引物p2(盛放于试剂瓶3)；设计引物p3(盛放于试剂瓶4)，p3与反义链互补，其3’端对应于可变位点O，且对应待检突变型的碱基，p3的5’端位置为C，p3的5’端包含一个或更多个与互补链不互补的碱基(下称末端保护碱基)，如星号所示。使用上述三个引物，采用分子生物学领域常规的PCR仪器与试剂对上述基因组DNA进行PCR反应。

步骤4：将上述PCR产物进行常规DNA电泳，例如琼脂糖凝胶电泳。

步骤5：采取任何常规手段，观察、读取和/或记录相应的凝胶图像。

实施例1的核心构思与结果判断：

当O点为野生型时，PCR产物为一条AB之间长度的片段；

鉴于p3的5’端与互补链不互补，p2与p3的PCR产物中P2的延长链侧不会与p1参与进一步的扩增反应，所以，当O点为突变型时，产物包括AB和CB对应的两个产物。

p3的5’端包括末端保护碱基，保证了CB之间扩增产物不会被延长，这就实现了在一个电泳泳道中对一次PCR产物进行判断，即，一个条带则推断样本为野生型，两个条带则推断样本为突变型。

因此，用该试剂盒配合常规仪器和试剂，可以最大限度地简化马恶性高热病的基因测试程序和降低成本。

P3的方向是可以变化的，当p3与上述定义的正义链互补，其3’端对应于可变位点O，且对应待检突变型的碱基，p3的5’端也包括末端保护碱基，整个方案可以使试剂盒达到相同的技术效果。为了方面统一说明本实用新型中试剂盒的检测原理，下文一律不提该方式，但本领域的技术人员可以知道，两种方式是等价的。

该试剂盒的测试步骤如下：

步骤一：采集马血清。

步骤二：使用GIGMA-ALDRICH公司的GenElute^TM血液基因组DNA试剂盒提取马血清的基因组DNA。

步骤三：兰尼定受体1基因(参考GenBank登录号AY375484)第56外显子的序列如下：

5’CTGTGCGCCA GAGATGCATC TAATCCAAGC CGGCAAAGGC GAAGCTCTGAGGATCGCGC CATCCTGCGC TCCCTCGTGC CCCTGGACGA CCTCGTGGGCATCATCAGCC TCCCTCTGCA GATCCCCACC CTGGGCAAAG

其中，方框所示位点野生型为C，导致马恶性高热病的序列中该位点为G。

根据上述对引物的定义：

P1序列为：5’-ATCTAATCCAAGCCGGC。

P2序列为：5’-CAGAGGGAGGCTGATGA。

P3序列为：5’-CCGAAGCTCTGAGGATCC。

根据上文的定义：AB的长度是101bp，CB的长度是80bp。

按照常规方法，在PCR反应管中添加引物P1、P2和P3共50pmol，2μg模板DNA,10μl 10×PCR缓冲液、1.5nnol/LMgCl₂，各200μmol/L dNTPs，2.5u Taq酶，加超纯水至总体积100μl。

反应条件：37℃启动15分钟，然后94℃所述的变性15秒钟，53℃退火30秒钟，72℃延伸15秒钟，38个循环，然后72℃保持10分钟。

步骤四：用2％琼脂糖，在0.5×TBE缓冲液下，在加样孔中加入EB和PCR产物，进行电泳。

步骤五：对电泳凝胶在紫外光下拍照。根据凝胶图谱来判断该兰尼定受体1基因是否发生了C7360G突变。

根据一次PCR和一次电泳来判断基因型，这使检测时间短，成本低。

实施例2

如图2所示，在实施例1的基础上，包装盒体1内设有盛放野生型反向引物的试剂瓶(5)。

该试剂盒的测试步骤的原理如下：

其测试中相对于实施例1的差别在于：步骤3中还包括引物p4(盛放于试剂瓶5)，p4与正义链互补，其3’端对应于可变位点O，且对应待检野生型的碱基，p4的5’端位置为D，其包含一个或更多个与互补链不互补的碱基，如星号所示。

步骤4中，在同一块凝胶的另一泳道中添加DNA分子量标记(Marker)。

实施例2的核心构思与结果判断：

参照对实施例1的说明，当O点为野生型时，电泳结果包括AB、AD；当O点为突变型时，电泳结果为AB、CB；当O点为杂合型时，电泳结果为AB、CB、AD。在此，要求AD与CB之间长度有差别，差别达到在同一个泳道中可以明显区别的程度。借助DNA分子量标记，则可以判断出样品该位点的基因型组成。

实施例2的试剂盒的应用，可以在一次PCR和一次凝胶电泳就区分出样品的基因型，而一块凝胶中还可以并行测试多个样品。

该试剂盒的测试步骤如下：

根据上述对引物的定义：

P4序列为：5’-CGAGCGCAGGATGGCGCC。

根据上文的定义：

AD的长度是56bp。

与实施例1中试剂盒的测试步骤相比，差别在于PCR反应体系中多了上述引物P4，另外在电泳的同一块凝胶中添加DNA分子量标记。

则对于野生型，电泳结果呈现101bp和56bp两个条带。对于突变型，电泳结果呈现101bp和80bp两个条带。对于杂合型，电泳结果呈现101bp、80bp和56bp三个个条带。

这就很方便用同一个电泳泳道的结果来判断样品的基因型。

实施例3

在实施例2的基础上，所述包装盒体1内设有盛放双链DNA参照序列的试剂瓶6。

该试剂盒的测试步骤的原理如下：

其测试中相对于实施例2的差别在于：不使用DNA分子量标记；在PCR产物中添加长度介于AD与CB之间的双链DNA参照序列(盛放于试剂瓶6)，要求此三者在同一泳道中电泳时能够区分电泳结果的边界，且双链DNA参照序列的含量明显大约AD与CB中的任一个。

实施例3的核心构思与结果判断：

对于杂合子，电泳结果中包含四个条带；对于纯合子则有三个条带，而根据迁移率较大条带与高亮度双链DNA参照序列的相对位置则可以判断其为野生型或突变型。例如，AD大于CB，则相对于高亮度的双链DNA参照序列的条带，迁移率较大的条带比该条带大则其为CB，判断样品为突变体，迁移率较大的条带比该条带小则其为AD，判断样品为野生型。

这在实施例2的基础上，进一步省去了DNA分子量标记的使用，使该试剂盒的使用更加方便，而且所有参与电泳的DNA在同一个泳道中进行电泳，结果更加清晰。

该试剂盒的测试步骤如下：

对于实施例3的电泳结果，突变型和野生型均呈现两个电泳条带，要想区分该两种情况，就需要通过DNA分子量标准来判断迁移率较大的条带是80bp和56bp中的那一条。

在电泳混合物中添加长度70bp，相对其他产物过量的双链DNA。

因此，可以通过判断迁移率较大的片段位于高亮条带的上游还是下游来判断对应的基因型。

作为该方案的一种变体，可以不约束双链DNA参照序列的用量。而是在一个泳道中电泳PCR混合物，在其相邻泳道电泳双链DNA参照序列，这就不需要控制双链DNA参照序列与PCR产物的相对含量。

实施例4

在实施例2的基础上，包装盒体1内设有盛放内参照序列的正向引物的试剂瓶7和盛放内参照序列的反向引物的试剂瓶8。

该试剂盒的测试步骤的原理如下：

实施例4的测试原理如下：其测试中相对于实施例2的差别在于：不使用DNA分子量标记；以同一基因组中的多拷贝少或无回文的DNA序列为模板，在其正向引物p5(盛放于试剂瓶7)和反向引物p6(盛放于试剂瓶8)的作用下形成了PCR产物，该PCR产物长度介于AD与CB之间的，要求此三者在同一泳道中电泳时能够区分电泳结果的边界。

实施例4的核心构思与结果判断：

由于该模板DNA序列是多拷贝的，所以PCR产物双链DNA内参照序列的含量明显大于AD与CB中的任一个。

实施例4与实施例3相似，二者的区别在于前者是在电泳样品中添加的对照序列，后者是在一个PCR体系中生成的对照序列。

这样，可以充分地用一次PCR产物和一次电泳来为基因进行分型检测。

测试步骤如下：

根据马α珠蛋白基因(GenBank登录号AH001203)设计如下上游引物和下游引物

正向引物p5：5’-GCTCACTCTCCTCTCCC。

反向引物p6：5’-GAAGTGGGGGAAGTAGG。

在PCR反应体系中加入上述引物对p5和p6，则它们对应的扩增产物长度为68bp，且由于α珠蛋白基因是多拷贝基因，该产物的丰度(条带亮度)会大于AD及CB。该方案可以实现测试目的。

作为一种变体，首先假设CB长度大于AD且小于AD的二倍，上游引物p7(盛放于试剂瓶7)与下游引物p8(盛放于试剂瓶8)位于同一个基因的A或B外侧，且p7与p8的产物长度等于AD，且以保证p7与p8的产物与AB分子数量差不多。这样，基因型为野生型时，电泳为两条带，迁移率较大的为p7与p8的产物和AD的混合物。如果是突变型，则迁移率由小到大的顺序为：AB、CB、p7与p8的产物，且三者丰度差不多，CB长度大于p7与p8的产物，所以对应条带略亮。如果是杂合型，则迁移率由小到大的顺序为：AB、CB、p7与p8的产物与AD的混合物，则迁移率最大的条带的亮度应该大于迁移率中间的。

根据兰尼定受体1基因第二外显子(GenBank登录号AY375476)：

上游引物p7：5’-TCAAGGAGCAGCTCAA。

下游引物p8：5’-GCAGAGGCGATTGCCG。

在PCR反应体系中加入上述引物对p7和p8，则它们对应的扩增产物长度为56bp的条带，该方案可以实现测试目的。

实施例5

在实施例1-4中任一个的基础上，包装盒体(1)内还设有用于PCR反应的试剂瓶组9。

其中，试剂瓶组9包括：用于盛放PCR缓冲液的试剂瓶、用于盛放MgCl₂的试剂瓶、用于盛放dNTPs的试剂瓶、用于盛放Taq酶的试剂瓶、用于盛放超纯水的试剂瓶。

实施例6

在实施例1-5中任一个的基础上，包装盒体(1)内还设有用于DNA电泳的试剂瓶组10。

其中，用于DNA电泳的试剂瓶组10包括：用于盛放琼脂糖的试剂瓶。用于盛放TBE缓冲液的试剂瓶。

实施例7

在实施例1-6中任一个的基础上，包装盒体1内还设有保温隔层11。

保温隔层11是任何可以延缓包装盒体1内外热交换的结构。

可选地，保温隔层11是泡沫材料制成的。

可选地，保温隔层11是双层不锈钢结构。

可选地，保温隔层11是双层玻璃结构。

可选地，保温隔层11与包装盒体1是一体成型的。

保温隔层11可以延缓包装盒体1内外热交换，以便在交通运输过程中包装盒体1内部保持低温，起到避免酶失活的作用。

实施例8

在实施例1-7中任一个的基础上，包装盒体1内还设有储冷剂包12。

可选地，储冷剂包12是内置冰块的塑料袋子。

储冷剂包的存在，能够使试剂盒保持低温的时间大大延长，延缓酶的活性丧失。

实施例9

在实施例1-8中任一个的基础上，包装盒体(1)内还设有样品收集试剂瓶13。

样品收集试剂瓶13可以与其他试剂瓶相同或不相同。

在采集样品和实验室距离较远时，用样品收集试剂瓶13容纳待测样品，可以起到避免或减少污染的作用，另外，在存在保温隔层11和/或储冷剂包12时，还可起到低温运输样品的作用。

样品收集试剂瓶13内可装有生理盐水、含有肝素的生理盐水或含有青霉素的生理盐水。

实施例10

在实施例1-9中任一个的基础上，包装盒体1内还设有试剂盒使用说明书14。

试剂盒的使用说明书14中详细记载了本实用新型所要求保护的试剂盒的测试原理和使用方法，以方便用户使用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对其构思作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均落入本实用新型要求保护的范围。