一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，包括RT引物的混合物和PCR扩增引物的混合物，RT引物的混合物和PCR扩增引物的混合物中分别包括基于基因群、内参基因、反应内标的各RT引物和各PCR扩增引物，还包括随机引物，基因群包括RRM1、TOP2A、ERCC1、TYMS、TUBB3、TOP1、PTEN、HER2、DPYD、EGFR；内参基因包括ACTB、GAPDH和B2M；反应内标是KAN-rRNA。本发明的用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒可一次性系统地检测多个与抗肿瘤用药密切相关基因的表达水平，使用简便，准确性好，检测效率高，可以很好地用于指导化疗用药，选择化疗方案。
【专利说明】一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因检测试剂盒，尤其是一种同步检测多种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒，属于医学分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]众所周知，化疗是当今肿瘤治疗中最常用的选择方案，但是半数以上的患者经过化疗后常常疗效不大，同样的肿瘤药物对于不同病人的疗效往往会有很大的差异；同时化疗药物毒副作用较大，其在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，有时还可出现并发症，许多患者因为化疗的强烈毒副作用而倍受折磨，甚至死亡。大量临床研究证实，单凭经验治疗肿瘤，一般只有30%以下的疗效，且毒副作用明显。药物遗传学和药物基因组学的研究表明，不同病人基因表达水平的差异导致对各种抗肿瘤药物的疗效差异。[0003]2012年Nature杂志已有文章指出，临床诊断已由传统地依赖于病理诊断方式转为更大程度上依据分子检测结果，分子检测已成为临床诊断的必要检测手段。高水平的分子检测手段及产品已为新时代的个体化治疗铺平道路。依赖于药物遗传学和药物基因组学在抗肿瘤药物作用机制等方面的最新研究成果，利用某些抗肿瘤药物的作用效果与相关基因表达的显著相关性机制，我们在进行化疗方案的选择前若能方便、快捷且准确地对病人的相关基因进行系统检测，可显著提高药物疗效并减轻毒副作用，并有效争取治疗时间，最终使病人在疗效和经济上获益。
[0004]目前与抗肿瘤用药最为密切相关的基因包括:PTEN (phosphatase and tensinhomolog,同源性憐酸酶-张力蛋白)、EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)、DPYD (dihydropyrimide dehydrogenase, 二氢嘧唳脱氢酶)、HER2 (humanepidermal growth factor receptor-2,人类表皮生长因子受体 2)、RRM1 (ribonucleotidereductase Ml,核糖核苷酸还原酶 Ml)、ERCCl (excision repair cross complementation1，切除修复交叉互补基因I)、TUBB3 (tubulin-beta 3，beta-微管蛋白3)、TOPl(topoisomerase I，拓扑异构酶 l)、TYMS(thymidylate synthetase,胸苷酸合成酶)、T0P2A(topoisomerase DNA II alpha,拓扑异构酶2)等,这些祀标基因mRNA水平的高低可指导诸如赫赛汀、吉非替尼、氟类、抗微管类等多种化疗药物的选择，以实施个体化治疗方案，提高疗效。
[0005]目前检测基因表达情况的常用方法有:FISH、免疫组化、荧光定量PCR (qPCR)、基因芯片等。其中，FISH是使用荧光标记的探针去检测组织切片上的RNA表达情况；免疫组化是使用抗体去检测组织切片上的蛋白表达情况。但是这两种方法的缺点都是无法定量，且实验结果必须要由有经验的检测员进行观察并主观判断。另外，基因芯片技术通常可以同时检测上千个甚至上万个基因的转录水平，但常应用于全基因表达谱的分析，用如此高通量的方法进行某些特定基因群的表达水平分析会导致成本太高，很难满足实际需求。而荧光定量PCR (qPCR)是检测RNA表达的常规技术，也是检测肿瘤组织基因表达情况的最常用的技术。但是如果需要检测多个基因的表达情况，则大多需要逐一对各个基因进行检测，且难以设置内参基因，通量低，成本高、便捷性差。
[0006]在一个反应体系中应用多对引物进行PCR扩增以期检测多个基因，即进行多重基因检测，需反复对扩增条件进行优化调整和验证，并需选择和验证合适的引物序列，若有成熟应用的检测产品将节省大量的人力和物力。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种使用简便，准确性好，检测效率高的用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，可一次性系统地检测多个与抗肿瘤用药密切相关基因的表达水平。
[0008]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，包括RT引物的混合物和PCR扩增引物的混合物，所述RT引物的混合物中包括基于基因群、内参基因和反应内标的各RT引物，所述PCR扩增引物的混合物中包括基于相应基因群、内参基因和反应内标的各PCR扩增引物，还包括随机引物，所述基因群包括 RRM1、T0P2A、ERCCU TYMS, TUBB3、TOPU PTEN、HER2、DPYD, EGFR ;所述内参基因包括ACTB、GAPDH和B2M ;所述反应内标是KAN_r RNA。
[0009]上述各PCR扩增引物序列由特异性引物序列和5 ’端的正向通用引物序列组成，所述各RT引物序列由特异性引物序列和5’端的反向通用引物序列组成；
基于所述RRMl的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.1所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.2所示；
基于所述T0P2A的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.3所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.4所示；
基于所述ERCCl的PCR扩增引 物的特异性引物序列如SEQ ID N0.5所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.6所示；
基于所述TYMS的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.7所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.8所示；
基于所述TUBB3的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.9所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.10所示；
基于所述TOPl的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.11所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.12所示；
基于所述PTEN的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.13所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.14所示；
基于所述HER2的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.15所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.16所示；
基于所述DPYD的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.17所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.18所示；
基于所述EGFR的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.19所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.20所示；
基于所述ACTB的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.21所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.2 2所示；基于所述GAPDH的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.23所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.24所示；
基于所述B2M的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.25所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.26所示；
基于所述KAN-r的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.27所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.28所示。
[0010]上述技术方案的优选是:所述随机引物在反应体系中的浓度为25nM~40nM ;基于所述 RRM1、T0P2A、ERCCU TYMS, TUBB3、TOPU PTEN, HER2、DPYD, EGFR、ACTB, GAPDH、B2M 和KAN-r基因的PCR扩增引物在反应体系中的浓度为150nM~250nM ;基于所述RRMl基因的RT引物在反应体系中的浓度为40nM~60nM ;基于T0P2A、PTEN和ERCCl基因的RT引物在反应体系中的浓度为 200nM ~300nM ;基于 TYMS、TUBB3、TOPU HER2、DPYD, EGFR 和 KAN_r基因的RT引物在反应体系中的浓度为450nM~550nM ;基于ACTB、GAPDH和B2M基因的RT引物在反应体系中的浓度为20nM~30nM。
[0011]上述技术方案的进一步优选是:上述随机引物在反应体系中的浓度为33nM ;基于所述 RRMl、T0P2A、ERCCU TYMS, TUBB3、TOPU PTEN, HER2、DPYD, EGFR、ACTB, GAPDH、B2M 和KAN-r基因的PCR扩增引物在反应体系中的浓度为200nM ;基于所述RRMl基因的RT引物在反应体系中的浓度为50nM ;基于T0P2A、PTEN和ERCCl基因的RT引物在反应体系中的浓度为250nM ;基于TYMS、TUBB3、TOP 1、HER2、DPYD、EGFR和KAN_r基因的RT引物在反应体系中的浓度为500nM ;基于ACTB、GAPDH和B2M基因的RT引物在反应体系中的浓度为25nM。 [0012]上述用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，还包括正向通用引物和反向通用引物的混合物；所述正向通用引物为荧光标记引物；所述正向通用引物序列如SEQ IDN0.29所示,所述反向通用引物序列如SEQ ID N0.30所示；所述正向通用引物和反向通用引物在反应体系中的浓度均为0.8μΜ~1.2μΜ。
[0013]上述正向通用引物的荧光标记包括Cy5、Cy3或FAM。
[0014]上述技术方案的优选是:上述正向通用引物和反向通用引物在反应体系中的浓度均为1.ΟμΜ。
[0015]上述用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒还包括反转录酶、反转录缓冲液、KAN-r RNA、DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP和超纯水。
[0016]上述用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒还包括阳性对照品，所述阳性对照品是从相应的多种肿瘤细胞中提取的RNA混合物，所述阳性对照品包括所述基因群、内参基因和反应内标的mRNA。作为RT反应后的PCR反应的阳性对照品还可以是基于所述基因群、内参基因和反应内标的PCR扩增引物和RT引物克隆所得的DNA片段的混合物。
[0017]上述用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒的检测方法的步骤如下:提取RNA后先用随机引物进行反转录反应，再使用PCR扩增引物的混合物、RT引物的混合物、正向通用引物和反向通用引物进行PCR扩增反应，之后进行毛细管电泳分析。
[0018]上述用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒的应用是指导化疗用药，选择化疗方案。
[0019]本发明具有积极的效果:
(I)本发明的多重基因检测试剂盒采用KAN-r作为反应内标能有效监测反应体系的正常工作，排除初始RNA模板量差异带来的误差，而传统方法中用载体等作为反应内标，易导致其高效扩增从而影响目标基因的有效扩增而导致结果判断的偏差；本发明还采用三个内参基因作为PCR反应对照，所要检测的10个目的基因的表达水平将会通过这三个内参基因进行均一化，克服了传统PCR中由于不均等扩增造成的偏差，实现精确定量一组目的基因的表达水平。上述内参及内标的设置结合GeXP的毛细管电泳及荧光检测技术，不同于传统凝胶电泳分析模式，使PCR结果分析更直观、简洁、可靠，易于识别判断，更有利于标准化操作，实现了超高灵敏度及最大程度降低了假阳性问题。
[0020](2)本发明的多重基因检测试剂盒对反应体系进行了优化，主要对各引物序列进行了多次筛选以尽可能避免引物间的干扰问题；反复调整各个引物的合适浓度，优化了反应体系。本发明的多重基因检测试剂盒利用荧光标记通用引物结合针对与化疗方案选择密切相关的十个基因的特异引物实现了在一个PCR体系内同步系统化检测十个目的基因位点，实现了检测的快捷和便利，准确性也得到了单重反应的验证。
[0021](3)本发明的多重基因检测试剂盒利用了 GenomeLab GeXP遗传分析系统高通量及自动化优势，采用96孔上样系统进行多样本规模化检测，操作便捷，使用条件可以模式化，便于大规模推广应用。每个样本的检测成本在50元内。实现了高通量，低成本，为系统用药指导争取了时间。
[0022](4)本发明的多重基因检测，对与化疗方案选择密切相关的10个基因进行同步检测的产品开发，并进行标准化和规模化的应用推广，具有通量高、成本低、便捷、重复性好、准确性好等特点，为调整所需检测目标基因的不同类型试剂盒的成功研制提供了借鉴。
[0023](5)本发明的多重基因检测试剂盒用随机引物先行进行反转录，不但有利于避免污染，且为后续扩展所需检测的目标基因提供了方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为采用本发明试剂盒对多种肿瘤细胞提取的RNA混合物进行RT、PCR及利用GeXP系统进行毛细管电泳分析后的图谱。
【具体实施方式】
[0025]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领 域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0026]一、试剂盒的组成。
[0027]本发明用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒包括固定在纸质包装盒内的以下试管:
1)RT酶(反转录酶)；
2)RT缓冲液(反转录缓冲液)；3)RT引物的混合物(反转录引物的混合物)；
4)KAN-r RNA ；
5)DNA聚合酶；
6)PCR缓冲液(含氯化镁)；
7)dNTP ；
8)PCR扩增引物的混合物；
9)正向通用引物和反向通用引物的混合物；
10)阳性对照品；
11)超纯水(无RNA酶/DNA酶)；
12)随机引物。
[0028]随机引物采用Takara公司生产的商品名为Random primer (9 mer)的随机引物，其编号为code D3802。优选随机引物在反应体系中的浓度为33nM。
[0029]各个PCR扩增引物5 ’端设有正向通用引物序列，各个RT引物的5 ’端设有反向通用引物序列。
[0030]正向通用引物的序列为:AGGTGACACTATAGAATA。
[0031]反向通用引物的序 列为:GTACGACTCACTATAGGGA。
[0032]正向通用引物上带有Cy5荧光标记。
[0033]阳性对照品是从多种肿瘤细胞提取的RNA混合物，包含所述基因群、内参基因和反应内标的mRNA。
[0034]RT引物和PCR扩增引物的序列根据下表1中各基因的mRNA序列跨外显子设计。每对扩增引物都可以扩增出特定长度的PCR片段。不同基因对应的扩增理论片段长度如表I所示，实际片段长度可能会略有不同。
[0035]RT引物的混合物和PCR扩增引物的混合物中各RT引物和PCR扩增引物的浓度如表1所示。正向通用引物和反向通用引物浓度远高于RT引物和PCR扩增引物的浓度。优选正向通用引物和反向通用引物的浓度均为1.ΟμΜ。
[0036]表1引物特 征表
【权利要求】
1.一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，包括RT引物的混合物和PCR扩增引物的混合物，所述RT引物的混合物中包括基于基因群、内参基因和反应内标的各RT引物，所述PCR扩增引物的混合物中包括基于相应基因群、内参基因和反应内标的各PCR扩增引物，其特征在于:还包括随机引物，所述基因群包括RRMl、T0P2A、ERCCl、TYMS, TUBB3、TOPl、PTEN、HER2、DPYD, EGFR ;所述内参基因包括ACTB、GAPDH和B2M ;所述反应内标是KAN_rRNA。
2.根据权利要求1所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述各PCR扩增引物序列由特异性引物序列和5’端的正向通用引物序列组成，所述各RT引物序列由特异性引物序列和5’端的反向通用引物序列组成； 基于所述RRMl的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.1所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.2所示； 基于所述T0P2A的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.3所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.4所示； 基于所述ERCCl的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.5所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.6所示； 基于所述TYMS的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.7所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.8所示； 基于所述TUBB3的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.9所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.10所示； 基于所述TOPl的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.11所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.12所示； 基于所述PTEN的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.13所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.14所示； 基于所述HER2的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.15所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.16所示； 基于所述DPYD的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.17所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.18所示； 基于所述EGFR的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.19所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.20所示； 基于所述ACTB的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.21所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.22所示； 基于所述GAPDH的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.23所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.24所示； 基于所述B2M的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.25所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.26所示； 基于所述KAN-r的PCR扩增引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.27所示，RT引物的特异性引物序列如SEQ ID N0.28所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述随机引物在反应体系中的浓度为25nM~40nM ;基于所述RRM1、T0P2A、ERCCUTYMS、TUBB3、TOP1、PTEN、HER2、DPYD、EGFR、ACTB、GAPDH、B2M 和 KAN_r 基因的 PCR 扩增引物在反应体系中的浓度为150nM~250nM ;基于所述RRMl基因的RT引物在反应体系中的浓度为40nM~60nM ;基于T0P2A、ERCCl和PTEN基因的RT引物在反应体系中的浓度为200nM ~300nM ;基于 TYMS、TUBB3、TOP1、HER2、DPYD, EGFR 和 KAN_r 基因的 RT 引物在反应体系中的浓度为450nM~550nM ;基于ACTB、GAPDH和B2M基因的RT引物在反应体系中的浓度为20nM~30nM。
4.根据权利要求3所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述随机引物在反应体系中的浓度为33nM ;基于所述RRM1、T0P2A、ERCC1、TYMS、TUBB3、TOP1、PTEN、HER2、DPYD, EGFR、ACTB、GAPDH、B2M 和 KAN_r 基因的 PCR 扩增引物在反应体系中的浓度为200nM ;基于所述RRMl基因的RT引物在反应体系中的浓度为50nM ;基于T0P2A、ERCCl和PTEN基因的RT引物在反应体系中的浓度为250nM ;基于TYMS、TUBB3、T0P1、HER2、DPYD、EGFR和KAN_r基因的RT引物在反应体系中的浓度为500nM ;基于ACTB、GAPDH和B2M基因的RT引物在反应体系中的浓度为25nM。
5.根据权利要求1至4之一所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:还包括正向通用引物和反向通用引物的混合物；所述正向通用引物为荧光标记引物；所述正向通用引物序列如SEQ ID N0.29所示，所述反向通用引物序列如SEQ IDN0.30所示；所述正向通用引物和反向通用引物在反应体系中的浓度均为0.8μΜ~1.2μΜ。
6.根据权利要求5所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述正向通用引物的荧光标记包括Cy5、Cy3或FAM。
7.根据权利要求1至4之一所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:还包括反转录酶、反转录缓冲液、KAN-r RNA、DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP和超纯水。
8.根据权利要求1至4 之一所述的一种用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒，其特征在于:还包括阳性对照品，所述阳性对照品是从相应的多种肿瘤细胞中提取的RNA混合物，所述阳性对照品包括所述基因群、内参基因和反应内标的mRNA。
9.一种上述权利要求1至5之一所述的用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于:提取RNA后先用随机引物进行反转录反应，再使用PCR扩增引物的混合物、RT引物的混合物、正向通用引物和反向通用引物进行PCR扩增反应，之后进行毛细管电泳分析。
10.一种上述权利要求1所述的用于化疗方案选择的多重基因检测试剂盒的应用，其特征在于:指导化疗用药，选择化疗方案。
【文档编号】C12Q1/68GK103882139SQ201410135943
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】赵新泰, 王明, 唐娟娟 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司