一种快速检测g6pd缺乏症基因突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，包括扩增检测试剂，所述扩增检测试剂包括下述(1)?(5)中的至少一个引物对：(1)用于检测G6PD基因G1376T突变位点的特异扩增引物对；(2)用于检测G6PD基因G1388A突变位点的特异扩增引物对，(3)用于检测G6PD基因A95G突变位点的特异扩增引物对，(4)用于检测G6PD基因G871T突变位点的特异扩增引物对，(5)用于检测G6PD基因C1024T突变位点的特异扩增引物对。当试剂盒同时包括上述5对引物时，可以实现在单个反应管中同时检测G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型。
【专利说明】
-种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及医学检测技术领域，具体设及一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖-6-憐酸脱氨酶（glucose-6-phosphatedehy化ogenase ,G6PD)缺乏是常见 的遗传性红细胞酶病，又称蚕豆病，它是糖酵解憐酸戊糖旁路中的一个关键酶和限速酶，并 普遍存在各种生物细胞内。G6H)缺乏会引起药物性溶血、感染性溶血和非球形细胞溶血性 贫血等疾病的发生，新生儿由急性溶血性贫血可引起核黄痘，严重可导致智力低下等情况 的发生。
[0003] G6PD缺乏症在世界范围内都比较普遍，并具有区域特异性，在热带和亚热带地区 该病发病率较高，存在南高北低的趋势，不同民族差异明显，同一地区差异不显著等特点。 在高发区G6PD缺乏症是引起新生儿高胆红素血症最主要的原因，严重者可因脑神经系统损 害导致不可逆的智能和身体残疾，因此联合国卫生组织把该病列入6种主要应该预防和控 制的遗传病之一。
[0004] G6PD缺乏症的分子基础是基因突变，G6ro基因是一个看家基因，位于X染色体长臂 的2区8带，基因全长20114bp，由13个外显子和12个内含子组成，编码区长1548bp，编码515 个氨基酸。随着对G6PD分子结构的不断阐明和研究的不断深入，用WHO标准化方法鉴定的 G6PD生化变异型达400余种，基因突变型达到140余种。在中国人群中，A95G、G1376T、 G1388A、G871T、C1024T等5种突变类型是中国人群中最常见基因突变型，约占总突变率的 90%W 上。
[000引自1991年化en等报告了基因全序列后，G6PD研究进入了基因水平，目前我国对常 见已知G6PD基因突变的筛查方法有等位基因寡核巧酸探针杂交（Alleles-specific oligonucleotide probe，AS0)，该方法需要比较繁琐的PCR后的杂交盒洗脱等步骤，不仅操 作繁琐，而且如果杂交或洗脱的条件控制不好时，易出现假阴性或假阳性的结果。错配碱基 聚合酶反应/限制性内切酶图谱分析也能实现突变位点的检测，但此方法同样较为繁琐，而 且经常出现酶切不完全的现象，造成结果判断不准确。杜传书报道的突变特异性扩增系统 (ARMS)在中国人常见突变的检测中具有简便、快速、准确和经济等特点，但由于引物设计要 求较高，早期还不能实现单管同时检测多个突变位点，因此，增加了实验的繁琐性，不利于 突变位点检测的广泛推广应用。
[0006]随着分子诊断技术的不断发展，更多的检测方法应用于G6PD基因突变的检测。近 年来发展起来的一种自动化、高通量的基因筛查技术一变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid化romatogra地ty，DHPLC)，已广泛用于遗传病基因突变筛查和 单核巧酸多态性（Single Nucleotide Polymo;rphisms,SNP)的分析。运类技术的出现使 G6PD突变的检测相对较便捷和稳定，但该方法需要较为昂贵的仪器设备，因此，也不利于市 级W下单位的推广应用。高分辨率烙解曲线化RM)对G6PD基因进行未知突变检测，有一定的 优越性与易操作性，但是对于常见突变位点的检测，往往需要多管操作，因而不利于常见突 变位点的筛查使用。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，具 体来说是一种基于多重突变特异性扩增系统(ARMS)-多重烙解曲线技术快速检测G6PD基因 位点613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5种突变类型的突变的试剂盒。采用该试剂盒 可在单管中同时检测613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5种突变类型，而且在检测时 无需进行PCR后的电泳检测分析，直接通过烙解曲线方法就能判断扩增的有无，检测更为快 速、简便，且检测结果准确。
[0008] 本发明所述的快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特 征在于:所述的扩增检测试剂包括下述(1)-(5)中的至少一个引物对：
[0009] (1)用于检测G6PD基因 G1376T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分 别如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示；
[0010] (2)用于检测G6PD基因 G1388A突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分 别如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:3所示；
[0011] (3)用于检测G6PD基因 A95G突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别 如沈Q ID NO:4和沈Q ID NO:5所示；
[0012] (4)用于检测G6TO基因 G871T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别 如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:7所示；
[001引（5)用于检测G6PD基因 C1024T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分 别如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:8所示。
[0014] 本发明试剂盒中所设及的引物是针对已知突变位点的G1376T、G1388A、A95G、 G871T、C1024T等5种突变类型的位点引物，引物能特异的扩增发生突变的运5个位点，未发 生突变的位点不会有扩增。本发明试剂盒中的引物对SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2用于检测 G1376T位点的突变情况;SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3用于检测G1388A位点的突变情况;SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5用于检测A95G位点的突变情况;SEQ ID N0:6和沈Q ID N0:7用于检 巧化871T位点的突变情况;SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:8用于检测C1024T位点的突变情况。其 中，SEQ ID NO: 1既作为检测G1376T位点突变的引物对中的上游序列，同时也作为检测 G1388A位点突变的引物对中的上游序列；SEQ ID N0:6既作为检测C1024T位点突变的引物 对中的上游序列，同时也作为检测G871T位点突变的引物对中的上游序列。
[0015] 在实际的应用过程中，本发明所述试剂盒中每对引物均可单独使用，也可将其任 意组合使用。当试剂盒包括上述（1)-(5)中全部的引物对时，可W实现在单个反应管中同时 检测 613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5种突变类型。
[0016] 本发明所述试剂盒采用的是烙解曲线法，因此，本发明试剂盒中还包括巧光染料， 具体可W是LC Green染料、SYBR Green I染料、G-Green染料或现有技术中常规使用的其它 染料。优选采用LC Green染料，运样可W进一步提高检测结果的准确性、稳定性和分辨率。
[0017] 本发明所述试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模 板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dNTP、Mgh等。
[0018] 本发明所述试剂盒用于检测613761\613884、4956、68711'、(：10241'等5种突变类型， 检测原理如下:本发明所述的试剂盒引物仅能特异的扩增发生突变的上述5种类型的位点， 如果发生突变，相应的，在检测烙解曲线的结果中就会有烙解曲线峰；而如果没有发生不 变，检测烙解曲线的结果就没有烙解曲线峰。
[0019] 同时，不同突变位点的烙解曲线的烙点也不相同。当本发明试剂盒中的巧光染料 为LC Green染料，酶液、缓冲液及其它现有试剂盒中的常规且必须组分(如dNTP、Mgh等）均 为北京康为世纪生物科技有限公司的产品时，本试剂盒对各突变位点进行扩增所得的扩增 产物的烙点分别如下：突变位点613761\613884、4956、68711'和(：10241'的突变扩增产物的烙 点分别为 78.5±0.2°(：、81.0±0.2°(：、83.5±0.2°(：、86±0.2°(：和87.5±0.2°(：，进一步确定 为78.5 °C、8rC、83.5 °C、86 °C和87.5 °C。可见，采用本发明所述试剂盒通过不同烙解曲线烙 点的分析就能判断突变的位点和类型。
[0020] 与现有技术相比，当本发明所述试剂盒同时包括（1)-(5)中全部的引物对时，可W 实现在单个反应管中同时检测613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5种突变类型，在口〇? 后仪器即可自动检测结果；而传统的ARMS不仅需要多管处理，而且需要PCR后电泳检测（如 在检测本试剂盒中所提到的5种类型的突变时，传统的ARMS方法需要5个PCR管，分别检测运 5种类型的突变;在扩增完成后，还需要通过电泳检测是否有扩增片段，从而再判断突变的 情况），因此，本发明所述试剂盒具有快速、简便、准确、可批量化、应用广泛、成本低廉等诸 多优点。
【附图说明】
[0021] 图1为G1376T突变位点扩增产物的烙解曲线；
[0022] 图2为G1388A突变位点扩增产物的烙解曲线；
[0023] 图3为A95G突变位点扩增产物的烙解曲线；
[0024] 图4为G871T突变位点扩增产物的烙解曲线；
[0025] 图5为C1024T突变位点扩增产物的烙解曲线。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，W更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于W下实施例。
[0027] 实施例1:采用本发明所述试剂盒对正常标本、G1376T突变样本、G1388A突变样本、 A95G突变样本、G871T突变样本和C1024T突变样本共1种正常样本和5种突变类型的样本进 行检测。
[0028] 1、突变特异性扩增系统引物的设计
[0029] 突变特异性扩增系统(ARMS)最重要的是如何设计出特异性的引物，因为野生型和 突变型的序列几乎完全相同，只是突变位点具有一个碱基的差异，因此，如果仅仅W突变位 点为引物末端进行扩增，在扩增过程中很容易出现假阴性或假阳性的扩增产物，从而影响 诊断的准确性。因此，还需要在突变位点之前的引物序列，人为的引入1-3个不相匹配的碱 基，从而提高扩增的特异性。
[0030] 2、试剂盒的组成：
[0031] 2.1ARMS 引物
[0032] (1)用于检测G6PD基因 G1376T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分 别如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示：
[0033] CAAGCCATACTATGTCCCCTCAG(SEQ ID N0：1)；
[0034] TGAAAATACGCCAGGCCTCAA(SEQ ID NO：2)；
[0035] (2)用于检测G6PD基因 G1388A突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分 别如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:3所示：
[0036] CAAGCCATACTATGTCCCCTCAG(SEQ ID N0：1)；
[0037] TGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT(沈Q ID N0:3);
[0038] (3)用于检测G6PD基因 A95G突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别 如沈Q ID NO:4和沈Q ID NO:5所示：
[0039] CCCTGAGCCGGACCCA(SEQ ID NO：4)；
[0040] GATGCACCCATGATGATGAATTTGC(沈Q ID N0:5);
[0041 ] (4)用于检测G6PD基因 G871T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别 如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:7所示：
[0042] TGAGCTGGGCCTCTGGCAG(SEQ ID N0：6)；
[0043] TGCTCCTCTGAGATGCATTTCATCAT(沈Q ID N0:7);
[0044] (5)用于检测G6PD基因 C1024T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分 别如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:8所示：
[0045] TGAGCTGGGCCTCTGGCAG(SEQ ID N0：6)；
[0046] CCACCTCTCATTCTCCACATTGAA(SEQ ID N0：8)〇
[0047] 2.2其它组成成分：
[004引 Hotstar-Taq酶，缓冲液，LC Green染料，dATP、dTTP、dCTP和dGTPW及Mgh均购自北 京康为世纪生物科技有限公司。
[0049] 3、PCR反应体系的配制：
[0050] 按下述表1配制PCR反应体系：
[0051] 表1: (ml表示mmol/L，yM表示皿ol/L)
[0化2]
[0053] PCR反应体系为50uL。
[0化4] 4、样本的来源及处理
[0055]样本来源于经测序分析，已经确认为5种突变类型的样本，DNA样本采用实验室常 规DNA提取方法进行提取，W双蒸水稀释至20ngAiL，并于-20°C保存备用。
[0056] 5、PCR扩增程序：
[0057] PCR反应所用仪器为普通的PCR仪。PCR反应程序为:95Γ预变性10min;95°C15sec， 60°C30sec，72°Clmin，32个循环;在72°C延伸lOmin;然后从72°C到92°C进行烙解曲线分析。 [0化引 6、结果检测与分析：
[0059] 试剂盒检测5种突变位点，只要有突变发生，即可扩增出相应的扩增产物，而不同 的扩增产物其烙解曲线的烙点都有差异，因而可W根据不同烙解曲线烙点的差异判断突变 的类型。其中：
[0060] G1376T突变位点的扩增产物烙解曲线的烙点为78.5Γ(如图1所示）；
[0061] G1388A突变位点的扩增产物烙解曲线的烙点为SrC (如图2所示）；
[0062] A95G突变位点的扩增产物的烙点为83.5Γ(如图3所示）；
[0063] G871T突变位点的扩增产物烙解曲线的烙点为86°C (如图4所示）；
[0064] C1024T突变位点的扩增产物烙解曲线的烙点为87.5°C (如图5所示）。
[00化]实验结果显示，试剂盒的检测体系能非常有效检测出G1376T、G1388A、A95G、G871T 和C1024T的突变位点，与测序结果一致，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。
[0066] 实施例2:用实施例1所述试剂盒、方法、步骤等对临床标本进行检测
[0067] 采用试剂盒对62例筛查阳性的样本进行检测，同时对本方法检测阳性的样本进行 测序验证，W确认本方法的准确性。
[006引判断依据：
[0069] 当扩增产物烙解曲线的烙点为78.5Γ时判定为位点G1376T突变；
[0070] 当扩增产物烙解曲线的烙点为SrC时判定为位点G1388A突变；
[0071 ]当扩增产物烙解曲线的烙点为83.5 °C时判定为位点A95G突变；
[0072] 当扩增产物烙解曲线的烙点为86 °C时判定为位点G871T突变；
[0073] 当扩增产物烙解曲线的烙点为87.5Γ时判定为位点C1024T突变。
[0074] 对62例筛查阳性样本的检测结果见表2。
[0075] 表2:G6PD基因突变的检测结果
[0076]
[0077]
[0078] 实验结果表明，本发明所述基于多重突变特异性扩增系统(ARMS)-多重烙解曲线 技术的试剂盒可实现单管同时检测G6PD基因突变位点613761\613884、4956、68711'和 C1024T等5种突变类型的检测，检测结果与测序方法一致，准确率为100%，结果可读性好， 分析、检测过程简单、高效。
【主权项】
1. 一种快速检测G6ro缺乏症基因突变的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于:所述 的扩增检测试剂包括下述(1)-(5)中的至少一个引物对： (1) 用于检测G6PD基因 G1376T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如 SEQIDN0:GPSEQIDN0:2m*; (2) 用于检测G6PD基因 G1388A突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如 SEQIDN0:GPSEQIDN0:3m*; (3) 用于检测G6H)基因 A95G突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； (4) 用于检测G6PD基因 G871T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如 SEQIDN0:6和SEQIDN0:7所示； (5) 用于检测G6PD基因 C1024T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如 SEQIDN0:6和SEQIDN0:8所示。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:该试剂盒还包括荧光染料。3. 据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光染料为L C G r e e η染料、S Y B R Green I染料或G-Green染料。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括缓冲液、酶 液、Mg2+和 dNTP。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：当试剂盒中的荧光染料为LC Green染 料，酶液及缓冲液均为北京康为世纪生物科技有限公司的产品时，本试剂盒对各突变位点 进行扩增所得的扩增产物的熔点分别如下： (1 )G1376T突变位点的扩增产物的熔点为78.5 ±0.2°C ; (2) G1388A突变位点的扩增产物的熔点为81.0±0.2°C ; (3) A95G突变位点的扩增产物的熔点为83.5 ±0.2°C ; (4) G871T突变位点的扩增产物的熔点为86±0.2°C; (5) C1024T突变位点的扩增产物的熔点为87.5±0.2°C。
【文档编号】C12Q1/68GK106011285SQ201610594099
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】樊祖茜, 孙雷, 唐维骏
【申请人】钦州市妇幼保健院