检测mthfr酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其中所述引物包括第一、第二引物对，所述探针包括第一、第二探针对，所述第一引物对包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示序列。本发明还公开了基于所述引物和探针的试剂、试剂盒等。本发明所设计的引物和探针具有良好的特异性，能够灵敏地检测MTHFR基因rs1801131、rs1801133位点突变，检测过程简单、耗时短，污染少，且所用的反应体系和反应条件稳定，检测结果可靠，灵敏性高，适于对体液样本进行高通量的快速检测。
【专利说明】
检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种冠屯、病遗传风险因子检测方法，特别设及一种检测MTHFR酶活性 或叶酸代谢能力的引物和探针、试剂盒及其应用，属于分子生物学和医学领域。
【背景技术】
[0002] 冠屯、病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成屯、 肌缺血、缺氧或坏死而导致的屯、脏病。大量的流行病学调查研究表明血浆同型半脫氨酸水 平升高与动脉粥样硬化性血管疾病危险增加有关，且血浆同型半脫氨酸与动脉粥样硬化性 血管疾病之间存在着一种强烈的剂量依赖关系，运种关系不依赖于传统的致动脉粥样硬化 性血管疾病的危险因子。造成高半脫氨酸的原因基本上分为遗传性代谢和获得性代谢障碍 两大类。其中遗传性代谢可归因于血浆同型半脫氨酸代谢过程中的关键酶的基因突变，运 会导致酶活性下降，使甲硫氨酸代谢障碍，导致血浆同型半脫氨酸在体内蓄积。
[0003] 目前研究中，MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半脫 氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。而同型半脫氨酸、叶酸代谢与许多疾病(Down综合症- 先天愚型、神经管疾病、屯、血管疾病等）相关。MTHFR为5，l〇-methylenete1:rahyhofolate reductase(NADPH)，亚甲基四氨叶酸还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中 将5,10-亚甲基四氨叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氨叶酸。5-甲基四氨叶酸可W 进一步进入甲基传递通路，通过同型半脫氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白 质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半脫氨酸水平保持在一个较低的水平，高浓度的同 型半脫氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的屯、脑血管致病因素。此外叶酸的中间代谢 产物在核巧酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嚷岭环的形成提供碳原 子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的素乱，包括细胞周期调控、DNA复制、 DNAW及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、屯、脑血管疾病等多种病症。现 已发现MTHFR基因有多种突变类型，不同的基因突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生 不同的影响，表现出各种不同的酶活性和热稳定性。一般说来，设及进化上保守序列的突变 会引起酶活性的急剧下降，危害性比较大;相反，处于非保守序列的突变对酶的活性影响较 小，危害性也较小。rslSOl 133为MTHFR基因中的一个SNP位点MTHFR C677T，是一个常见的不 耐热错义突变。MTHFR基因第677位密码子C被T置换，从而使一个高度保守的丙氨酸变成了 鄉氨酸，同时产生了一个HInfl和化ql限制性酶切位点。C677T位于MTHFR催化区域，该突变 直接影响亚甲基四氨叶酸还原酶的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性降低并伴有酶 的耐热性降低。
[0004] 为实现对冠屯、病遗传风险因子的检测，研究人员发展出了多种方法，其中较为常 见的一种方式是构建对应于运些风险因子的试剂盒，但是现有的此类试剂盒在应用时往往 存在准确性较差等问题，且通量较低，难W进行实际应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是提供一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针、 试剂盒及其应用，W克服现有技术中不足。
[0006] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0007] 本发明实施例提供了一种检测MTWR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其中： 所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所 述第一引物对包括SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，所述第二引物对包括 SEQ ID NO. 3和沈Q ID NO.4所示的核巧酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核巧 酸序列。
[0008] 进一步的，所述第一引物对和第二引物对中各引物的末端还连接有巧光标记物， 所述巧光标记物包括FAM或VIC。
[0009] 本发明实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能 力的试剂中的用途。
[0010] 本发明实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能 力的试剂盒中的用途。
[0011] 本发明实施例还提供了一种用于检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂，其包 含所述的引物和探针。
[0012] 本发明实施例还提供了一种用于MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒，其包含 所述的引物和探针。
[0013] 进一步的，所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系W及用于提取待测样 品DNA的试剂。
[0014] 本发明实施例还提供了所述的引物和探针、所述的试剂、或者所述的试剂盒于制 备冠屯、病遗传风险因子检测试剂或试剂盒中的用途。
[0015] 与现有技术相比较，本发明通过设计特异性的引物对和探针对，能实现对MTHFR基 因中rsl801131、rsl801133位点进行快速、准确地检测，操作简单、成本低，结果精确，可W 实现高通量检测，具有广泛应用前景。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合一些典型实施例进一步阐述本发明的技术方案。
[0017] 需要说明的是，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照Sambrook 等人、分子克隆、实验室手册（New York:Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989)等 所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
[0018] 在本发明的如下实施例主要提供了一种检测冠屯、病遗传风险因子的引物对、试 剂、试剂盒等。更具体的说，如下实施例提供了一种检测MTWR酶活性或者叶酸代谢能力的 引物和探针、试剂、试剂盒，其设及的基因位点主要为MTHFR基因中的rs 1801131位点及 rsl801133位点。
[0019] 其中，该MTHFR基因单核巧酸多态性位点rsl801131位点、rsl801133位点均与冠屯、 病密切相关。而MTHFR基因的详细序列可参见ht化://www. ncbi . nlm. nih. gov/。
[0020]进一步的，本发明实施例提供的一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和 探针中，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对， 其中所述第一引物对包括SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，所述第二引物对 包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核巧酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的 核巧酸序列
[0021] 其中，所述第一引物对对应于rsl801131位点，其包含的两条引物可分别命名为 rsl801131-fp(沈Q ID N0.1)和rsl801131-rp(沈Q ID N0.2)。
[0022] 其中，所述第二引物对对应于rsl801133位点，其包含的两条引物可分别命名为 rsl801133-fp(沈Q ID N0.3)和rsl801133-rp(沈Q ID N0.4)。
[0023] 其中，所述第一探针对对应于rsl801131位点，其包含的两条探针可分别命名为 rsl801131-FAM(SEQ ID N0.5)和rsl801131-VIC(SEQ ID N0.6)。
[0024] 其中，所述第二探针对对应于rsl801133位点，其包含的两条探针可分别命名为 rsl801133-FAM(SEQ ID N0.7)和rsl801133-VIC(SEQ ID N0.8)。
[0025] 其中，FAM(簇基巧光素）、VIC为连接于各探针尾端的巧光基团。
[0026] 本发明实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能 力的试剂或试剂盒中的用途。
[0027] 相应的，本发明实施例还提供了一种用于检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试 剂，其包含所述的引物和探针。
[00%]相应的，本发明实施例还提供了一种用于MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒， 其包含所述的引物和探针。
[0029] 进一步的，所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系W及用于提取待测样 品DNA的试剂。
[0030] 本发明实施例还提供了所述的引物和探针、所述的试剂、或者所述的试剂盒于制 备冠屯、病遗传风险因子检测试剂或试剂盒中的用途。
[0031] 本发明实施例还提供了基于前述引物和探针、试剂或试剂盒的检测冠屯、病易感位 点的方法，其可W包括如下步骤：
[0032] (1)提取样品的基因组DNA;
[0033] (2) W待测牛的基因组DNA为模板，用上述引物对和探针对进行PCR扩增；
[0034] (3)对步骤(2)的扩增产物进行基因型判定：如果探针所标记巧光染料(FAM，其激 发波长465nm，发射波长510nm)的巧光强度增长，而探针所标记巧光染料(VIC，其激发波长 53化m，发射波长580nm)的巧光强度无增长，表示被测样本基因型存在突变;反之，如果探针 所标记巧光染料(VIC)的巧光强度增长，而探针所标记巧光染料(FAM)的巧光强度无增长， 表示被测样本基因型无突变;如果两种巧光强度均增长，则被测样本基因型存在突变。
[0035] (4)最后可W通过专口的分析软件，进行等位基因分型。
[0036] 为了便于检测结果分析，可在PCR扩增步骤中增加已知基因型的阳性对照和阴性 对照。
[0037] 较之现有技术，本发明所设计的引物和探针具有良好的特异性，能够灵敏地检测 MTHFR基因 rs 1801131位点、rs 1801133位点突变，检测过程只经一个反应步骤，即可得出判 型结果，无需PCR后反应，步骤简单、耗时短，污染少，且所用的反应体系和反应条件稳定，检 测结果可靠。而且，本发明工作流程简单，只需混合DM模板、引物和探针试剂即可进行仪器 检测，易于掌握，且灵敏性高，对DNA的浓度要求低(可低至Ing)，适于对体液样本进行高通 量的快速检测。
[003引实施例；
[0039] 一、巧光PCR检测
[0040] 1、实验材料
[0041 ] LightCycler480巧光定量PCR仪购自瑞：t罗氏（Roche)公司，聚合酶链反应液 (XightCycler480High Resolution Melting Master)由瑞:t罗氏（Roche)公司定制合成。
[0042] 2、引物及探针设计与合成：
[0043] WMTHFR基因外显子的部分序列为模板，使用Primer Premie巧软件分析引物、探 针，并由上海生工生物工程有限公司定制合成。
[0044] 检测用引物：
[0045] MTHFR 基因 rsl801131 上游引物序列 rsl801131-fp:
[0046] 5' -AGAGCAAGTCCCCCAAGGA-3'(沈Q ID NO. 1);
[0047] MTHFR 基因 rsl801131 下游引物序列 rsl801131-巧：
[004引 5'-GAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGAC-3' (SEQ ID NO.2)。
[0049] MTHFR 基因 rsl801133上游引物序列rsl801133-fp:
[0050] 5'-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3' (SEQ ID NO.3);
[0化1] MTHFR基因 rsl801133下游引物序列rsl801133-巧：
[0052] 日'-CGGTGCATGCCTTCACAA-3'(沈Q ID N0.4)。
[0053] 检测用探针：
[0化4] MTHFR 基因 rsl801131 探针 rsl801131-FAM:
[0055] 5' -ACCAGTGAAGAAAG-3'(沈Q ID NO. 5);
[0056] MTHFR 基因 rsl801131 探针 rsl801131-VIC:
[0057] 5' -ACCAGTGAAGCAAG-3'(沈Q ID NO. 6);
[0化引 MTHFR基因甘31801133探针'31801133斗施：
[0059] 5'-CTGCGGGAGTCGA-3' (SFQ ID NO.7);
[0060] MTHFR基因 r s 1801133探针r s 1801133-VIC:
[0061 ] 5/-CTGCGGGAGCCGA-3/(沈Q ID N0.8)。
[0062] 3、样本检测：实验共检测50例冠屯、病病例和50例正常对照人群，每例收集血样标 本约2ml，用酪/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（Themo Fisher公司）检测。
[0063] 按如下体系进行巧光PCR扩增，最后用roche LC480softwarel .5扫描并聚类分析：
[0064] ?5μΙ 2X Light Cycler480High Resolution Melting Master Mix [00化]1.2^25πιΜ MgCb溶液
[0066] 化L 2μΜ Primer Mix
[0067] 化L 5ngAiL左右DNA
[006引 1.祉L出0
[0069] 反应总体积10化，其可在384孔板中进行。
[0070]
[0071] 4、基因组DM抽提的检测结果：所有样本的基因组DM符合检测要求（260/280> 1.8，浓度>10雌/41^。
[0072] 二、Taqman法检测冠屯、病rsl801131、rsl801133位点的基因型
[0073] 用Taqman法检测冠屯、病遗传风险基因 MTHFR基因的rsl801131、rsl801133位点。挑 选上述冠屯、病病例-对照组样本各10例进行化qman分型实验，判断rsl801131、rsl801133的 基因型。
[0074] 1、实验方法
[0075] 化qman探针方法使用美国应用生物系统公司的化qman探针，苏州新海生物科技有 限公司的化qman Mix。
[0076] 按如下体系进行PCR扩增，最后用roche LC480softwarel.5扫描并聚类分析：
[0077] SjiLTaqman Mix
[0078] 0.1化 Taqman Probe
[0079] 化L 2μΜ Primer Mix
[0080] 化 L5ng/yL 左右 DM
[0081 ] 3.化 LH2O
[0082] 反应总体积10化，其可在384孔板中进行。
[0083]
[0084] 2、实验结果:20例化qman分型结果与Li曲t切cler480巧光PCR的HRM分析结果完全 一致。
[0085] 3、MTHFR基因 rsl801131、rsl801133基因型和冠屯、病易感的关联分析
[00化]MTHFR基因 rsl801131、rsl801133在冠屯、病病人和对照中分布的比较采用RxCx2检 验。用SPSS软件进行统计分析，检测结果证实，rsl801131、rsl801133基因型和冠屯、病易感 存在显著关联。
[0087] Ξ、该实施例还提供了一类冠屯、病易感位点的检测试剂盒，其可W对MTHFR基因外 显子中包含rsl801131、rsl801133位点的区域进行扩增及分析，该检测试剂盒可W检测冠 屯、病的易感性，其包含有可扩增出MTHFR基因外显子中包含rsl801131、rsl801133位点的特 异性引物及探针和其他PCR反应所需辅助试剂。
[0088] 检测试剂盒供50人份检测应用，于-20°C避光保存，其组分及含量包括：
[0089] f5yL2X Light Cycler 480Hi曲 Resolution Melting Master Mix
[0090] 1.2^25πιΜ MgCb溶液
[0091] 化L2yM Primer Mix
[0092] 化 LSng/μΙ 左右 DM
[0093] 1.祉L 出0
[0094] 具有沈Q ID NO:1~沈Q ID NO:4所示序列的特异性引物各0.2uM;
[0095] 具有沈Q ID NO:5~沈Q ID NO:8所示序列的探针各0.2uM。
[0096] 籍由该试剂盒，利用前述的方法检测不同人群的MTHFR基因中rsl801131、 rsl801133位点的基因型，W此判断不同个体患冠屯、病的发病风险，并将检测结果与其它方 法（例如PCR-单链构象多态性（single-strand conformationalpolymor曲ism，SSCP)法）的 检测结果对照，证实该试剂盒可用于精确(检测限可达Ing)、快速的检测。
[0097] 应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此 项技术的人±能够了解本发明的内容并据W实施，并不能W此限制本发明的保护范围。凡 根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其特征在于:所述引物包括第 一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包 括SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQIDN0.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6所示的核苷 酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于:所述第一引物对和第二引物对中各 引物的末端还连接有荧光标记物，所述荧光标记物包括FAM或VIC。3. 权利要求1或2所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂中 的用途。4. 权利要求1或2所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒 中的用途。5. -种用于检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂，其特征在于:所述试剂包含权利 要求1或2所述的引物和探针。6. -种用于MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含权利 要求1或2所述的引物和探针。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲 液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。8. 权利要求1或2所述的引物和探针、权利要求5所述的试剂、或者权利要求6-7中任一 项所述的试剂盒于制备冠心病遗传风险因子检测试剂或试剂盒中的用途。
【文档编号】C12N15/11GK106011282SQ201610579688
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】黄迅威
【申请人】苏州康吉诊断试剂有限公司