一种检测致病性犬钩端螺旋体的荧光pcr引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测致病性犬钩端螺旋体的荧光 PCR引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种在全世界范围传播的人畜共患疾病，简称 钩体病，该病尤其广泛存在于发展中国家和热带地区。犬对该病易感，感染后临床表现多 样，不易进行诊断。钩体病的病原体会持续存在于宿主机体内，会进一步扩散污染环境，感 染其他人和动物，危害严重。因而，犬患该病后，在危害其本身的健康的同时，还会威胁到其 主人的安全。因此，需要在早期对该病作出诊断，尽早控制该病。目前，诊断犬钩体病的方法 有直接镜检、分离培养、血清学检测、动物接种等实验室检测方法，与这些方法相比，PCR方 法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩体病的早期诊断。
[0003][0004]
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种省时省力，特异性和 敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物及试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早 期诊断。
[0006] 本发明原理在于选择了犬钩端螺旋体LigB基因作为检测对象，并针对犬钩端螺旋 体LigB基因特殊设计了引物，使引物具有优异的特异性和敏感性。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0008] 本发明提供一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物，所述引物如下：
[0009] 上游引物：5' -CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA -3' ；
[0010] 下游引物：5 ' -GATCCTTGTATTCCACCGATG-3 ' ；
[0011] 所述探针为：
[0012] 5 '-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3 '。
[0013] 本发明还提供了所述引物与探针在制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒方面 的应用。
[0014] 由于所述引物的扩增片段能够证明犬钩端螺旋体LigB基因的存在，从而证明致病 性犬钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒。
[0015] 在所述引物的存在下，加入配合使用的所述探针，能都在荧光PCR仪上进行荧光定 量PCR的检测。
[0016] 基于上述原因，本发明还提供了含有所述引物与探针的试剂或试剂盒。
[0017] 具体为一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物和探 针、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10 X Buf f er、ddH20。
[0018] 进一步地，所述阳性对照的构建方法为：
[0019 ] 1)以黄疸出血56601的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩 增，对PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T进行连接；
[0020] 2)向Transl-Tl克隆感受态中加入步骤1)获得的连接产物，筛选阳性克隆，提取质 粒。
[0021] 黄疸出血5 6 6 01购自中国药品生物制品检定所钩端螺旋体实验室，保藏编号为 56601 〇
[0022]为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的检测，本发明优化了所述试剂盒的工作 程序(尤其是退火温度），使所述引物能够最大程度地增加反应成功率和反应效果。
[0023]优化得到的工作程序为：
[0024] 94Γ 3min; 94Γ 20s，58 °C 50s，读板，35 个循环。
[0025] 应用本试剂盒进行荧光定量PCR以后，把得到的CT值带入标准曲线方程，就可以得 出钩体的浓度。对钩体的检测定性就够了，但能定量更好，本试剂盒不但能定性，还能定量。 为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的荧光定量检测，本发明还优化了所述试剂盒的工 作体系(尤其是引物浓度和探针浓度），最大程度地提高灵敏度，降低检出限。
[0026] 优化得到的PCR工作体系为20yL:Premix Ex TaqlOyL，上下游引物各0.8yL，Probe 0.6yL，模板 lyL，ddH20 补足。
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] 本发明选择LigB基因作为检测对象，实现检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明 提供了省时省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物、探针及试 剂盒。本发明提供的引物、探针和试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中， 建立并组装的犬钩体病荧光定量PCR试剂盒检测灵敏度为lOVopies/yL，钩体浓度检测灵 敏度为1 X 101钩体/mL，可满足检测需要。
【附图说明】
[0029]图1是本发明实施例2中退火温度的电泳检测结果图；其中，M:2000bp Marker，泳 道1 ~5:退火温度依次为56°C，57°C，58°C，59°C，60°C。
[0030]图2是本发明实施例2中摸索引物浓度的结果图：其中，上下游引物反应终浓度梯 度为0.1~0.8μΜ，间隔为0. ΙμΜ。
[0031 ]图3是本发明实施例2中摸索探针浓度的结果图：探针反应终浓度梯度为0.1~0.5 HM，间隔为0. ΙμΜ。
[0032]图4是本发明实施例3中DNA标准品扩增曲线图：其中每一条曲线对应一定浓度的 DNA模板。从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为1，10-1，10-2，10- 3，10-4，10-5，10-6ng/yL， 相应的检测到的扩增起始循环数依次增大。
[0033]图5是本发明实施例3中DNA标准品标准曲线图，X轴从左到右依次为DNA模板浓度 1，10-1，10-2，10-3，10-4，10- 5，10-6ng/yL，Y 轴为 CT 值。
[0034]图6是本发明实施例4中荧光定量PCR重复性试验结果，是3个不同浓度钩体DNA标 准品的3个重复。
[0035] 图7是本发明实施例5中特异性试验曲线图，其中从左到右为标准菌株黄疸出血 56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635，非致病性钩 体566505和空白对照。
[0036] 图8是本发明实施例8中质粒标准品的荧光定量PCR结果图，从左至右，每一条曲线 代表的标准阳性质粒浓度依次为10°~1〇 8。
[0037] 图9是本发明实施例8中质粒标准品标准曲线图，其中X轴为CT值，Y轴位lg(浓度 copies/uL)，分别为 105~10°copies/uL。
[0038] 图10是本发明实施例8中最低检测钩体菌液浓度标准曲线图，其中，X轴位lg (菌液 浓度），从左到右依次为101~1〇7钩体/ml，Y轴位CT值。
【具体实施方式】
[0039] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 1、菌株和临床样本
[0043] 钩端螺旋体标准菌株黄疸出血56601，犬56603,波摩那56608,流感伤寒56609,七 日热56610,塔拉索夫56635,非致病性钩体566505,由课题所在实验室传代培养保存。
[0044] 2、主要仪器和试剂
[0045] 凝胶电泳图像分析系统（北京六一仪器厂，中国）；梯度PCR仪(Biometra UNO，德 国）；C02恒温培养箱(SANYO,日本），细菌基因组DNA提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自天根 公司，质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司，；Taq酶、pMD_18t载体、Transl-Tl克隆感受态购 自大连宝生物有限公司；胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，氨苄青霉素购自NEB公司，氯化钠、 琼脂糖等常规试剂购自国产公司。
[0046] 实施例1引物设计与合成
[0047] 根据GenBank中已发表的LigB基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计得到 引物，经筛选得到本发明所述的引物。
[0048] 筛选得到的引物通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，如表1所示。引物均由大连 宝生物公司合成。
[0049] 表1通用引物序列
[0050]
[0051 ]实施例2荧光定量PCR反应条件和反应体系的优化
[0052] 1、根据细菌组DNA提取试剂盒产品说明，从生长良好的黄疸出血56601菌液提取 DNA作为模板，首先对PCR反应的退火温度进行摸索，反应体系为20yL体系：Premix Ex TaqlOyL，上下游引物各0 · 8yL，Probe 0 · 6yL，模板lyL，ddH20补足。
[0053]在梯度PCR仪上进行，设置温度梯度为：56.0 °C，57.0 °C，58.0 °C，59.0 °C，60.0 °C。 以摸索出的最佳退火温度，进行引物浓度的优化。结果如图1所示，由图1可知，当退火温度 为58.0 °C时，条带最亮，检测效果最好。
[0054] 2、保持Taq酶，dNTP，探针，10 X Buf f er，模板的加样量及终浓度不变，对上下游引 物进行梯度稀释加样，用去离子水进行补足，使上下游引物反应终浓度梯度为〇. 1~〇. 8μΜ， 间隔为Ο.ΙμΜ。选取得到平均最低CT值时的引物浓度。结果如图2所示，由图2可知，引物浓度 为0.4μΜ时，平均C