高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒，属于水产病原菌快 速检测领域。
【背景技术】
[0002] 我国是全球对虾养殖产量第一大国，2012年产量为165万吨，占全球养殖产量的 40%，2013年对虾急性肝胰腺坏死病导致全球养殖对虾减产23%，泰国减产54%，我国减产 17%，广东减产30%，养殖时间超过80天池塘的对虾急性肝胰腺坏死病发生率超过了80%， 年直接经济损失超过50亿元。近两年该病更加严重。急性肝胰腺坏死病的主要致病菌为一 种特异性的副溶血弧菌，该菌的致病性与质粒上编码的PirA和PirB毒素有关。目前对于虾 类高致病性副溶血弧菌的检测，主要采用传统的细菌分离鉴定，血清学反应及PCR检测技 术，传统的细菌分离鉴定耗时长，操作复杂，而且不能将该特异的副溶血弧菌和传统的副溶 血弧菌分离开，而PCR方法能准确鉴定特异性副溶血弧菌，但成本高，需要专业的仪器设备 和技术人员，养殖生产中亟需一种能够应用于养殖现场的、快速准确、操作简便的高致病性 副溶血弧菌检测技术及其产品。
[0003] LAMP技术是由Notomi等于2000年首次建立的体外链置换核酸扩增的方法，近年来 被广泛研究、应用。它利用靶序列上6个关联区域设计的4条特异引物和1种高活性链置换 DNA聚合酶(BstDNA polymerase)，在等温条件（60~65°C )放置30~60min即可完成核酸扩 增反应，反应液中加入核酸染料SYBR Green I或钙黄绿素，若有核酸扩增即可显示颜色反 应，即时得到检测结果。该技术具有快速高效、灵敏度高、特异性强、产物易检测、操作简单 等优点。目如尚未有关于尚致病性副溶血弧菌LAMP检测技术的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高致病性副溶血弧菌快速检测引 物。
[0005] 本发明的第二个目的是提供能应用于现场检测的高致病性副溶血弧菌快速检测 试剂盒。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] 高致病性副溶血弧菌快速检测引物，由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物组成;所述内引物由 SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物组成。
[0008] 高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒，包括：
[0009] (1)TE缓冲液，其组成为20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，溶剂是蒸馏水，pH = 8.0；
[0010] (2)Bst DNA聚合酶:浓度为8UAU的Bst DNA聚合酶；
[0011] (3)LAMP反应液，每24μ1 LAMP反应液的组成为:2.5μ1 10X反应缓冲液;3μ1浓度 为2.5mmol/L的(1ΝΤΡ;1μ1浓度为5ymol/L的由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，ΙμL浓度 为5μmol/L的由SEQIDN0.2所示的外引物下游引物，lμl浓度为40μmol/L的由SEQIDN0.3 所示的内引物上游引物，ΙμL浓度为40ymol/L的由SEQ ID NO. 4所示的内引物下游引物；ΙμL 钙黄绿素与锰离子形成的配合物、13.5μ1 DEPC水；
[0012] ⑷阳性对照膜片，用下述方法制成:吸取高致病性副溶血弧菌培养液将FTA膜片 充分润湿后室温干燥，放入盛有200μ1ΤΕ缓冲液的洗涤管中震荡洗涤1次，每次2min，充分干 燥；
[0013] (5)阴性对照膜片，用下述方法制成:吸取DEPC7K将FTA膜片充分润湿后室温干燥， 放入盛有200μ1ΤΕ缓冲液的洗涤管震荡洗涤1次，每次2min，充分干燥；
[0014] (6)无菌封装的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗涤管，检测管。
[0015] 本发明的优点：
[0016] (1)本发明解决了现有技术检测高致病性副溶血弧菌周期长、检测成本高、不能应 用于现场检测等问题，使检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了 检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错，对鱼体损伤小。
[0017] (2)本发明依据高致病性副溶血弧菌基因所设计的扩增引物能有效检测高致病性 副溶血弧菌，具有很好的特异性和准确性。
[0018] (3)采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结 果，避免了被扩增产物污染后续待检样品，提高了该试剂盒的应用可靠性。
[0019] (4)基于对取样方法的改进，不经过细菌培养，仅需取少量南美白对虾的鳃或肝胰 腺样品即可进行检测。
【附图说明】
[0020] 图1为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒检测结果示意图。
[0021 ]图2为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒实际应用检测结果图。
[0022]图3为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒灵敏性检测结果图。
[0023]图4为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒特异性检测结果图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，下面的实施例并不限制本发明，本 领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应 视为在本发明的范围内。
[0025]本发明所用仪器及试剂：
[0026]电热恒温水浴锅购自北京三二八科学仪器有限公司；Bst DNA聚合酶、10X反应缓 冲液、dNTP购自NEB公司；引物SEQIDN0·l、SEQIDN0·2、SEQIDN0·3、SEQIDN0·4均由 上海生工生物工程有限公司合成；DEPC水、Tris购自上海生工生物工程有限公司（（DEPC， (diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）丐黄绿素购自SIGMA公司;FTA膜片购自通用电 气医疗公司(GE healthcare) ;EDTA、硫酸锰为国产分析纯。
[0027] 钙黄绿素与锰离子形成的配合物配比为0.05mmol/L钙黄绿素和0.6mmol/L锰离 子。
[0028] 高致病性副溶血弧菌基因组DNA采用商业化的DNA抽提试剂盒(天根的快速DNA提 取检测试剂盒KG203)从纯培养的高致病性副溶血弧菌菌液中提取。
[0029] 高致病性副溶血弧菌是从患病南美白对虾鳃、肝胰腺中提取，经形态学、生化特性 分析及以16S rDNA为遗传标记的系统发育分析鉴定为高致病性副溶血弧菌。
[0030] 本发明可用于检测南美白对虾鳃、肝胰腺是否感染高致病性副溶血弧菌，也可用 于检测水体中是否含有高致病性副溶血弧菌或某菌液是否为高致病性副溶血弧菌。
[0031] 本发明所指高致病性副溶血弧菌是质粒上编码了 PirA和PirB毒素的菌。
[0032] 实施例1
[0033]高致病性副溶血弧菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，外引物由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。
[0034] 实施例2
[0035] 高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒，包括：
[0036] (1)TE缓冲液，其组成为20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，溶剂是蒸馏水，pH = 8.0；
[0037] (2)Bst DNA聚合酶:浓度为8UAU的Bst DNA聚合酶；
[0038] (3)LAMP反应液，24μ1 LAMP反应液的组成为：2·5μ1 10X反应缓冲液;3μ1浓度为 2.5mmol/L的dNTP;lyl浓度为5ymol/L的由SEQ ID Ν0.1所示的外引物上游引物，ΙμL浓度为 5μmol/L的由SEQIDN0.2所示的外引物下游引物，lμl浓度为40μmol/L的由SEQIDN0.3所 示的内引物上游引物，ΙμL浓度为40ymo 1/L的由SEQ ID Ν0.4所示的内引物下游引物；ΙμL钙 黄绿素与锰离子形成的配合物;13.5μ1 DEPC水；
[0039] (4)阳性对照膜片，用下述方法制成:吸取高致病性副溶血弧菌培养液将FTA膜片 充分润湿后室温干燥，放入盛有200μ1ΤΕ缓冲液的洗涤管中震荡洗涤1次，每次2min，充分干 燥；
[0040] (5)阴性对照膜片，用下述方法制成:吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥， 放入盛有200μ1ΤΕ缓冲液的洗涤管震荡洗涤1次，每次2min，充分干燥；
[0041] (6)无菌封装的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗涤管，检测管。
[0042] 实施例3
[0043]高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒检测方法的建立
[0044] (1)模板制备:采用DNA提取试剂盒(天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)提取的 纯培养的高致病性副溶血弧菌基因组DNA，作为阳性对照液，以纯培养的高致病性副溶血弧 菌菌液，作为检测样品，测试所建立检测方法的可行性。
[0045]