对副溶血弧菌k36，k37，k68特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001]本发明设及对副溶血弧菌（片ArioK36,K37,K68特异的核巧 酸，尤其设及对副溶血弧菌K36,K37,K68的K抗原基因簇中单个基因特异的核巧酸及其应 用。
【背景技术】
[0002] 副溶血弧菌（KZArio 如。CUS)属于弧菌科弧菌属中的一种，是一种嗜 盐的革兰氏阴性菌，能自由的生存在含有盐分的海洋或者河口环境中，是公认的引发临床 疾病的人类致病菌。于1950年从日本一次爆发性食物中毒中分离发现，包括创伤感染、败 血症和急性肠胃炎等。一般情况下副溶血弧菌能在水面下独立生存，或者与贝类共生，有些 菌株对环境要求苛刻并且对人类致病。具有致病性的菌株能引起人类食物中毒，使人或家 兔红细胞发生溶血，称神奈川试验阳性。人常因进食未煮熟的污染该菌的海产品或盐溃食 物而受感染。目前为止，确定血清型菌株中03 :K6、01:KUT和04 :K68被报道是毒力最强的 菌株，也是引发感染主要的血清型。
[0003]细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法W及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型运 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的K抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004]副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)的表面抗原，既有0抗原也有K抗原。目 前已确定副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)的正式血清型方案是确认了 13个K血清 型和71个血清K型。0抗原基因簇位于C03巧日御M么间，K抗原基因簇位于御巧日rig 之间。运种分类方法一直是研究菌株间流行病学关系的首选方法，并且在比对来自不同地 方不同时间的菌株方面尤为有用。对于其分子鉴定也越来越受到人们的重视，分子生物学 检测技术具有速度快且易于大规模使用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方 向。
[0005]近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（口巧序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFL巧分析等。分子生物学方法不仅可用于副溶血弧菌的快速血清分型筛查，稳定 的鉴定结果可W弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，运些基于多聚酶链 式反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、 灵敏、特异性强等优点。
[0006]聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的增菌过程，再通过离屯、及裂解制备细菌DNA 模板，就可W在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含 有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1. 5小时。运对检验检疫部口和临床 检验无疑是极大提高了工作速度，同时也降低了工作成本。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了本发明设及对副溶血弧菌（片如io K36,K37,K68特异的核巧酸，其特征在于所述的核巧酸具有： 1) 沈QIDNO: 1-6所示的核巧酸中的一种； 2) 与SEQIDNO: 1-6所示的核巧酸互补的核巧酸中的一种；所述的SEQIDNO: 1-6如 下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO: 1-6所示的核巧酸中的一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mldNTP30y1 ;10X酶特异性反应缓冲液50y1邵/y1耐热DNA聚合酶5y1 ;混合引 物IOiil(各标准菌株特异的上下游引物，单数为上游引物，双数为下游引物K4为SEQID NO: 1-2 ;K32为沈QIDNO:3-4 ;防4为沈QIDNO:5-6);阳性对照品10y1引物；阴性对照 品 10Ji1 ;(1地2〇 5ml。
[000引其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO: 1-6所示的核巧酸中的一种。
[0009] 本发明进一步公开了对副溶血弧菌（片Ario 曲oXrfic化0K36,K37,K68特 异的沈QIDNO: 1-6核巧酸在制备用于检测副溶血弧菌化拘山細70如。C化乂36，K37，K68的PCR试剂盒。
[0010] 本发明所述副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)指的是取样于创口感染、败 血症和急性肠炎等临床标本培养物的粗提液或是副溶血弧菌（VibrioParahaemolyticus) 的纯培养物的粗提液。收集副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)并提取基因组是采用 常规方法制备获得。
[0011] 针对副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)的PCR试剂盒，整个检测步骤包括 样品预处理一扩增一电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管 中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管，启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工 作。
[0012] 本发明还提供一种液相检测忍片，包括液相磁珠和连接在液相磁珠上的寡核巧酸 探针，W及相应探针所在片段所对应的相应引物；其中所述核巧酸优选为如SEQIDNO: 1-6 所示的核巧酸。
[0013] 本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸优选为如SEQ IDNO: 1-6所示的核巧酸。
[0014] 本发明进一步公开了对副溶血弧菌K36,K37,K68特异的核巧酸在制备用于检测 副溶血弧菌PCR试剂盒、检测副溶血弧菌的基因忍片方面、检测副溶血弧菌微阵列方面的 应用。所述的检测副溶血弧菌指的是检测引起伤口感染、败血症和急性肠炎。
[0015] 本发明公开的对副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)K36,K37,K68特异的核 巧酸与现有技术相比，本发明具有如下优点： (1)实用性强：本发明建立的一种PCR反应体系，可检测副溶血弧菌（V i br i O Par址aemolyticus),提供血清分型检测所用到的特异引物，利用该PCR方法可W对临床标 本进行检测。
[0016] (2)准确性高：本发明通过对副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)的各血清型 特异的基因的PCR反应，每个样品得到目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可 W得到副溶血弧菌所对应菌株编号。
[0017] (3)检测成本相对较低：可W推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品监测检验 检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的条件。其中副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)来源于台湾东 吴大学黄显宗和上海CDC(上海疾病防控中屯、)。
[001引连施例1:基闲紀的提取 37°C营养肉汤培养基培养副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus),收集细菌，提取 基因组具体步骤如下： 用500ul50mMTris-肥Up册.0)和IOul0. 4M邸TA重悬细胞，37°C溫育20分钟，然 后加入IOullOmg/ml的溶菌酶继续保溫20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小时，再加入3UllOmg/ml的RNase，65°C溫育30分钟。加等体积酪 抽提混合物，取上清液，再用等体积的酪：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)溶液抽提两次，取上清 液，再用等体积的乙酸抽提W除去残余的酪。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过0. 4%的琼脂 糖凝胶电泳检测。
[0020] 连施例2:序列破译 提取副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)K36，K37，K68标准菌株的基因组，通过Solexapair-end测序技术对副溶血弧菌（VibrioPar址aemolyticus)各标准基因组进行 全基因组测序获得该K血清型的序列，运用Blast及PSI-Blast进行序列比对，采用TMHMM Servers. 0program进行跨膜结构预测，运用ClustalWprogram进行序列对齐及筛选保守 和特定基因片段，最终获得副溶血弧菌各个血清型的K抗原基因簇序列及破译结果。
[00川连施例3:引物巧计 根据基因簇破译情况和建库比对结果，发现wzy和WZX基因是副溶血弧菌K抗原特异 的基因，所W选取该基因特异区段设计特异引物。由于wzy更加特异，所W主要Wwzy基因 为祀基因。
[0022] 引物设计是该发明的核屯、部分。设计引物根据文献中叙述的特异基因来设计。WZX 和wzy运两个基因是副溶血弧菌K抗原基因簇中比较特异的基因，可W作为血清型鉴定的 革己基因。将上述基因导入PrimerPremier5进行引物设计，引物的长度最好在18~24bp 之间，Tm值在53~58°C。每个基因设计一对引物，有单一目的条带。
[0023] 引物设计之后在Genbank中进行BLAST,设计的引物不能与其它近缘细菌的序列 相似性过高，运样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或 者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。运一点对于避免非特异条带的产生和实验 的成败十分重要。
[0024] 设计出的引物如表1所示。
[002引表1 用于PCR的引物序列
连施例4:特择引物的筛洗 收集了副溶血弧菌K36,K37,K68的标准菌株包括：6株弧菌属，1株沙口菌属菌株W及 1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表2。
[0026]表2用于特异性检测的菌株
基因鉴定引物筛选用到的PCR体系为5yM引物0. 4yI、10X酶特异性反应缓冲液 2. 5y1、IOmMdNTP0. 25y1、抓/y1耐热DNA聚合酶0. 2y1及3y1的待测样品模板到 0. 2ml的薄壁PCR管