快速检测食品中副溶血性弧菌tdh毒素的试剂盒及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种ELISA试剂盒，特别涉及一种快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，还涉及该试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌1DH毒素中的应用，属于食品安全检测
技术领域：
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背景技术：
】[0002]副溶血弧菌（miojOaraAaewoXKiciAs，简称K/?)是食品中常见的食源性致病微生物，主要存在于水产品特别是海产品中，它是每年引起我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原。产生的溶血毒素是该菌致病的主要原因，包括耐热直接溶血素(ThermostableDirectHemolysin，简称TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素（TDH-relatedhemolysin，TRH)和不耐热溶血素（ThermolabileHemolysin，简称TLH)，流行病学调查研究表明TDH是K/^最主要致病因子。[0003]目前国内检测食品中副溶血弧菌主要是按GB4789.7方法进行，该方法仍然是按照分离培养、生化鉴定等过程进行，不仅耗时，且操作复杂，灵敏度有限。应用PCR技术检测副溶血性弧菌及其TDH、TRH毒素已有研究，但此法具有耗资大的不足；相反，简便、快速、经济、敏感、特异的ELISA检测法是现代食品安全快速检测的发展趋势之一。[0004]据研究表明，环境中副溶血弧菌不全含有致病因子，也就是说不是所有的副溶血性弧菌都具有致病性。ELISA法对副溶血弧菌的检测研究比较少见，且不能区分所检测的副溶血弧菌是否具有致病性。应用ELISA技术检测副溶血弧菌IDH毒素的相关报道仍不多见，特别是利用免疫学技术制备副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体，并建立ELISA法来检测致病性副溶血性弧菌的研究更是极为少见，且检测副溶血弧菌TDH毒素的ELISA快速检测试剂盒尚未出现。【
发明内容】[0005]技术问题：发明所要解决的一个技术问题在于克服现有检测食品中副溶血性弧菌的检测时间长、检测费用高、且难以区分是否具有致病性等不足，提供了一种食品中副溶血性弧菌致病因子TDH毒素的DAS-ELISA法快速检测试剂盒，其检测准确性高，检测时间短，能够实现ELISA检测方法标准化检测。[0006]技术方案：本发明提供的快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒，包括：(1)酶标板：包被捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清；(2)TDH标准稀释液：副溶血性弧菌TDH毒素；(3)阴性对照：兔抗副溶血弧菌阴性血清；(4)检测抗体：兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清；(5)酶标二抗：山羊抗兔IgG-HRP;(6)空白对照液：0?01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline简称PBS)；(7)洗涤液：0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSalineTween-20，简称PBST);(8)底物溶液：包括A瓶和B瓶，A瓶为含4mg/100mL的邻苯二胺、pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液；B瓶为质量百分比浓度30%的H202;(9)终止液：2mol/LH2S04。[0007]作为优选，所述鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：将副溶血性弧菌TDH毒素分别与等量的弗氏不完全佐剂、等量的弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠；基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4呢IDH，随后每隔2周进行1次加强免疫，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清。[0008]作为另一种优选，所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：在0.05%甲醛、35°C下将产TDH毒素的致病性副溶血性弧菌灭活2h制得菌体抗原，分多次、剂量递增进耳静脉注射；免疫新西兰大白兔，免疫浓度为l〇sCFU/mL;在最后一次免疫结束后一周，耳动脉大量采血，即得兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清。[0009]作为另一种优选，兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的稀释度为1:4000~1:8000;所述山羊抗兔IgG-HRP的稀释度为1:1000~2000。[0010]作为另一种优选，所述副溶血性弧菌TDH毒素的制备方法，包括以下步骤：(l)TDH毒素粗品的制备：将产TDH毒素的副溶血弧菌接种于氯化钠碱性蛋白胨水溶液中在摇床中扩大培养后，离心去除菌体，上清液中加入（NH4)2S04,静置盐析以充分沉淀TDH毒素；高速离心，沉淀溶解在PBS溶液中，透析，即得TDH毒素粗品；(2)TDH毒素粗品的纯化：(2.UDEAE-纤维素离子交换柱层析：将步骤（1)制得的得TDH毒素粗品缓慢滴加到DEAE-纤维素离子交换柱中，用1L含0.2mol/L的NaCl的PBST溶液洗脱，再1L用含0.2~1.Omol/LNaCl的PBS溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液；加入固体（NH4)2S04盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；(2.2)HAP柱层析：将步骤（2.1)的透析液滴加到HAP柱上，用0.5L的含0.lmol/LNaCl的PBS液（pH7.0)洗脱，再用0.8L的0.1~0.3mol/L的PBS液（pH7.0)洗脱，收集洗脱液；加入固体（NH4)2S04盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；(2.3)SephadexG-25柱层析：将步骤（2.2)的透析液过SephadexG-25柱，用0?Olmol/LpH7.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液用PEG-20000浓缩，即得副溶血性弧菌TDH毒素。[0011]其中，步骤（1)中，所述氯化钠碱性蛋白胨的水溶液的质量百分比浓度为3%;扩大培养条件为：37°C、150r/min、24h;离心转速为6000r/min;(NH4)2S04加入量为优选35.lg/100mL上清液；盐析条件为优选4°C，10h;高速离心条件为10000r/min、4°C;PBS溶液的浓度为0.〇l〇mol/L，pH为7.0。[0012]其中，步骤（2.1)中，固体（順4)#04盐析的加入量为40g/100mL;透析温度优选4。。。[0013]作为另一种优选，所述包被捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：在新酶标板的每孔加入稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清100yL，烘干后加封闭液封闭酶标板，37°C恒温恒湿孵育80min，弃去多余封闭液，使用洗涤液注满各孔，轻摇2~4min，拍干，重复3次后扣干，即得；所述稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清为采用0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释的血清，稀释度1:2000~1:4000;所述封闭液为质量百分比浓度3~5%的牛血清白蛋白或3~5%脱脂奶粉。[0014]本发明还提供了上述ELISA试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素中的应用。[0015]所述应用，包括以下步骤：(1)样本前处理：以无菌操作称取食品样品，加入〇.〇lmol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液；将样品均液用絹纱过滤，于8000~10000r/min离心8~10min，取上清夜即为待检样品提取液；食品样品与磷酸盐缓冲液的用量比为25g:225mL；(2)在包被捕获抗体的酶标板的孔中，分别加入：100yL待检样品提取液或100yLTDH标准稀释液(绘制标准曲线时用于替换样品提取液)、100yL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照、100yL的PBS作为空白对照，封板膜封板，37°C恒温恒湿孵育60~80min;每孔加入用于绘制标准曲线的TDH标准稀释液，浓度分别为2yg/mL、4yg/mL、6yg/mL、8yg/mL、10yg/mL、12yg/mL;(3)洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；(4)每孔中加入100yL兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清，37°C恒温恒湿孵育6〇-70min；(5)洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：使用洗涤液选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；(6)每孔中加入100yL酶标二抗山羊抗兔IgG-HRP，37°C恒温恒湿孵育45~55min;(7)洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；(8)每孔中加入100yL底物溶液，30°C恒温恒湿闭光孵育15~25min;(9)每孔中加入50yL终止液，摇匀，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔0D492值；(10)结果判断：A、定性分析：样品0D492值/阴性对照平均0D492值多2.1，判断为阳性，否则为阴性；阴性对照〇D492值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际0D492值计算；B、定量分析：以0D492值为纵坐标，以TDH标准稀释液浓度（yg/mL)为横坐标，绘制标准曲线；根据样品的0D492值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位yg/g。[0016]有益效果：本发明提供以检测TDH毒素为研究对象，通过已制备的TDH毒素蛋白免疫BALB/C小鼠制备抗TDH多克隆抗体（TDHPolyclonalAntibody，简称TDH-PAb)，同时以致病性副溶血弧菌菌体作为免疫原免疫新西兰大白兔制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体PolyclonalAntibody，简称K/7-PAb)，以抗TDH多克隆抗体作为捕获抗体，抗菌体多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA检测法（DoubleAntibodySandwichELISA，简称DAS-ELISA)，并运用此法检测食品中副溶血弧菌IDH毒素，研制出食品中副溶血弧菌1DH毒素ELISA快速检测试剂盒。【附图说明】[0017]图1为100°C热处理对TDH毒素溶血活性的影响结果图。[0018]图2为副溶血弧菌IDH毒素多克隆抗体产生进程曲线图。[0019]图3为副溶血弧菌TDH毒素多抗交叉反应试验结果图。[0020]图4为副溶血弧菌IDH毒素敏感性试验结果图。[0021]图5为捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最适反应时间试验结果图。[0022]图6为酶标板封闭试验结果图。[0023]图7为检测抗体KfPAb与TD当前第1页1 2 3 4 5