材料 1. 1. 1主要器材 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、羟基磷灰石（HAP) (Sigma公司）；羊抗鼠IgG-HRP、牛 血清蛋白、S印hadexG-25 (生兴生物技术（南京）有限公司）;硫酸铵、邻苯二胺0PD、PBST (淮安国药化学试剂有限公司，AR);DEAE纤维素DE-52、透析袋(南京森贝伽生物科技有限公 司）;全自动酶标仪StatFax3200(Awareness公司）;微量移液枪NichpetEX(日本NICHIRY0 公司）；紫外可见光分光光度计UV2300(上海天美科学仪器有限公司）；可拆卸酶标板（上 海天呈医流科技有限公司产品）。
[0066] 1. 1. 2供试动物与菌株 6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠（复旦大学医学院实验动物中心）；产TDH毒素副溶血弧 菌ATCC33846、副溶血弧菌1.2164 (上海海洋大学食品安全实验室提供）;金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌、非致病性副溶血弧菌(编号江苏财经职业技术学 院微生物实验室保藏） 1. 2方法 1. 2. 1TDH毒素免疫原制备 将产TDH毒素副溶血弧菌ATCC33846接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中37°C下进行 150r/min摇床扩大培养24h后，经6000r/min离心去除菌体，按35.lg/100mL的量向上清 液中加入（NH4)2S04,充分溶解后于4°C下静置盐析过夜，以充分沉淀TDH毒素，于lOOOOr/ min，4°C下离心10min，弃上清，沉淀溶解在少量0. 01mol/LpH=7. 0的PBS溶液中，并以此 PBS溶液透析过夜，即得TDH毒素粗品。DEAE-纤维素离子交换柱层析：将此粗毒素液，采 用于DEAE-纤维素DE-25进行柱层析，方法如下：将于上述PBS液4°C平衡过夜的TDH毒素 粗品缓慢滴加到层析柱中，同时用约1L含0. 2mol/LNaCl上述PBST洗脱柱子，再用1L含 0. 2~1. 0/LNaCl的上述PBS进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，按40g/100mL的量加入固体 (NH4) #04进行盐析，沉淀再用上述PBS溶解后4°C透析过夜。HAP柱层析：将毒素滤液用HAP (2. 2X35cm)进行柱层析，用约500mL的0?lmol/L的PBS液（pH7. 0)洗脱，再用800mL的 0? 1~0. 3mol/L的PBS液（pH7. 0)洗脱，收集洗脱液，透析过夜方法同上。S印hadexG-25柱 层析：将经HAP柱层析的产物过S印hadexG-25柱(用0? 01mol/LTris-HCl缓冲液pH7. 0 平衡)，用同样的缓冲溶液洗脱柱子，洗脱液用PEG-20000浓缩一个小体积，即为本研究纯化 的TDH毒素，将其冷冻干燥后，得到纯化后的TDH毒素。将此TDH毒素与等量的弗氏不完全 佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，制得TDH免疫原。
[0067] 1. 2. 2 TDH毒素溶血性测定 参照文献(杨靖亚等.副溶血弧菌IDH单克隆抗体的研制与性质鉴定）方法进行。
[0068] 1. 2. 3 IDH毒素耐热性与毒性分析 由于TDH具有较大的毒性，免疫小鼠时，用量需要严格控制以免造成小鼠被毒死，无法 制备TDH多抗。本研究选取了6-8周龄的健康雌性BALB/c小鼠36只，体重上下相差不超 过3g，平均分成12组，分别按照14、12、10、6、2呢/只的剂量(见表1)腹腔注射本研究制备 的1DH毒素，记录各组小鼠的存活时间，确定其对小鼠的毒性剂量，试验过程中提供良好的 饲养环境。
[0069] 另取本试验制备的TDH毒素，以0.Olmol/LpH=7. 0的PBS溶液溶解后，均匀等分 成6等份，分别置于50、60、70、80、90、100°C的恒温水浴锅中进行加热，每隔3min，分别取样 测定其溶血活性，研究1DH的耐热性能。
[0070] 1. 2. 4TDH毒素多克隆抗体制备 选购6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠4只（编号BALB/c-l~4)，饲养观察1周无异样后， 从眼球采血，与TDH毒素做试管凝集试验，无凝集反应者用于制备阴性血清，-20°C保存。 取一定量纯化后TDH毒素分别于等量的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，分多 次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠，基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4呢（或 12l^g)TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫(免疫剂量见表3)，每隔2周进行1次鼠眼球采 血0. 5ml，测定免疫血清效价，在最后一次免疫结束后一周，眼球大量采血，血液移至4°C冰 箱过夜，取上清液，于3000r/min离心10min，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，置-20°C 冰箱保存。
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1. 2. 5间接ELISA法测定TDH毒素多克隆抗体效价 将免疫血清吸光值2. 1倍于阴性血清吸光值时，免疫血清的最大稀释倍数的倒数定义 为鼠抗TDH毒素多克隆抗体效价。采用预实验棋盘法确定TDH最适包被浓度为12呢/mL包 被酶标板，37°C恒温恒湿孵育2h，弃去多余包被液，以PBST洗板4次，拍干，5%的小牛血清 封闭抗原，封板37°C恒温恒湿孵育2h。弃去多余小牛血清，以PBST洗板4次，拍干。将TDH免疫血清进行倍比稀释，每孔加入100W的免疫血清和鼠阴性血清，同时以PBS代替血 清设置空白对照，封板37°C恒温恒湿孵育2h，弃去多余血清，用PBST洗板4次拍干，每孔加 入100W的1 :1000 (说明书推荐用量）的羊抗鼠IgG-HRP，37°C孵育lh，PBST洗板4次，拍 干，每孔加入100W的OPD，30°C恒温避光反应20min，每孔加入50W2mol/L的硫酸终止酶 反应，酶标仪中测定0D492值，并计算TDH毒素多克隆抗体效价。
[0072] 1. 2. 6特异性试验 将致病性的金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌和非致病性副溶血弧菌 菌株作为供试菌株，于细菌增菌液中37°C摇床培养24h后，培养液于10000r/min 离心lOmin，分别取各供试菌上清液和12Pg/mL的TDH溶液100W包被酶标板，每孔加入 1:64000的TDH免疫血清，同时以PBST代替血清设置空白对照，后续操作方法同1. 2. 5间接
ELISA法，测定各孔0D492。阳性判定标准为P/N彡2. 1，其中
[0073] 1. 2. 7敏感性试验 将TDH毒素以 0?Olmol/LpH=7. 0 的PBST溶液稀释成 10l^g/mL、9l^g/mL、8l^g/mL、7l^g/mL、6)^g/mL、4)^g/mL、2)^g/mL、lPg/mL，分别取100M1包被酶标板，进行间接ELISA试验，后续 操作步骤同1. 2. 5,根据1. 2. 6中P/N的判定标准，作为阳性判定依据，确定TDH多克隆抗体 的敏感性。
[0074] 2结果与分析 2. 1IDH毒素耐热性与毒性 表4可以看出，腹腔直接注射不含弗氏佐剂的TDH毒素，随着注射剂量增大，存活平均 时间明显降低，每只小鼠注射剂量为2呢以下无死亡现象，在2呢以上开始死亡，但每只注 射剂量由4呢升高到16呢时，小鼠平均存活时间由350. 3min减少到100. 8min;而结合弗 氏左剂得TDH毒素，对小白鼠得致死量明显提高，注射结合弗氏完全佐剂的TDH毒素对小鼠 的致死量在8呢以上，而结合弗氏不完全佐剂对小鼠的致死量在12呢以上，由此可见弗氏 左剂对TDH的毒性产生一定程度的影响，究其原因可能由于TDH毒素与弗氏左剂结合成" 油包水〃乳状液减缓了毒素进入血液的量和时间，从而降低其毒性，有关弗氏左剂降低IDH 毒性的机理需要进一步试验研究。根据由表2试验结果，为避免免疫进程中小白鼠的死亡 现象，更好的制备TDH多克隆抗体，可以初步确定免疫小鼠的结合弗氏不完全佐剂TDH剂量 控制在12呢/只，结合弗氏完全佐剂的TDH剂量控制在糾g/只以内。
[0075] 表4TDH毒素对BALB/c小鼠的毒性结果
表5结果表明，60°C处理组，在12min时出现部分溶血现象，溶血活性开始降低，达到 15min时，溶血活性完全丧失。而除60°C处理组外，其他处理组在18min以内，都无法消除 TDH溶血活性。说明TDH作为一种蛋白毒素，耐热性能很强，这种毒素蛋白可能在60°C下发 生某些基团的变化，造成溶血活性丧失，其机理有待于进一步研究。将此毒素在l〇〇°C下煮 沸一定时间，图1中1~6管号依次代表煮沸时间6~21min，每隔3min测定一次溶血活性，图 1显示1~4号管出现溶血现象，6号管开始无溶血现象，说明在第18min时TDH丧失溶血活 性，也就是说1DH在100°C下溶血活性可以维持15~18min。
[0076] 表5不同温度、热处理时间对TDH溶血活性的影响 iSS
S. iSS ： 注："++"表示完全溶血，"+"表示部分溶血，"一"表示无溶血现象。
[0077] 2.2 TDH毒素多抗产生进程 图2可以看出，1、2号小鼠产生抗体的效价，从第42天明显高于3、4号小鼠抗体效价， 说明采用第1组小鼠免疫方法可以获得高效价抗体，也即按照剂量递增的方法免疫小鼠， 更能刺激淋巴细胞分泌多克隆抗体。图2结果显示，在免疫的第56天产生了高价的TDH多 克隆抗体，抗体效价高达6.4X106。
[0078] 2. 3 TDH多抗特异性 图3结果显示，两株致病性副溶血性弧菌P/N值显著大于2. 1，呈现强阳性，而非致病 性的副溶血弧菌V.pl-4,致病性的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌的P/ N值明显低于2. 1，呈现阴性，说明该多克隆抗体具有很强的特异性，与上述菌株无任何交 叉反应。
[0079] 2. 4TDH多抗敏感性 从图4可以看出，随着TDH包被浓度的不断降低，P/N值迅速降低，当包被浓度下降至 6Pg/mL时，P/N为1. 75〈2. 1，即该TDH多抗最低可以检测到TDH的浓度为6l^g/mL。
[0080] 3 结论 本研究以致病性副溶血弧菌ATCC33846作为TDH毒素提取供试菌，先对其进行增菌培 养一定时间后，使其充分分泌TDH毒素后，采用硫酸铵盐析法提取粗毒素，再将此粗毒素依 次采用DEAE-纤维素柱层析、HAP柱层析和S印hadexG-25柱层析，进一步纯化TDH毒素，经 冷冻干燥后获得纯化后的1DH毒素，分析该蛋白的毒性、耐热性和溶血性。将此毒素蛋白分 别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂结合后制备TDH免疫原，分多次、不同剂量免疫BALB/ c小鼠，采血制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，采用间接ELISA法测定该抗体的效价、敏 感性与特异性。结果表明：利用该TDH毒素免疫小鼠时，结合弗氏不完全佐剂TDH剂量控制 在12呢/只，结合弗氏完全佐剂的TDH剂量控制在糾g/只以内。该TDH毒素溶血活性能在 100°C下维持15~18min，采用剂量递增法免疫小鼠可获得高效价TDH多克隆抗体，在免疫第 56天起，抗体效价显著提高，最高达6. 4X106,该抗体具有很强的特异性和敏感性，对TDH 毒素的检测灵敏度为6Pg/ml。