一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]四环素类抗生素包括金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。本品为广谱抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体也对本品敏感。
[0004]国内外的大量研究表明，由于四环素药物长期和大量使用，副溶血弧菌对四环素类药物的耐药性十分严重。常见的四环素耐药基因已经发现的有:TetA，TetB, TetC,TetD, TetE, TetG等。四环素耐药性菌株通过水产产品以及食物链等途径引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。
[0005]目前我国水产产品致病菌耐药性检测控制中，在四环素药耐药性检测研究方面，对病原菌耐药性基因的研究内容较少。传统方法是通过测定副溶血弧菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的副溶血弧菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法。
[0008]本发明的具体技术方案如下:
一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，包括如下步骤:
(1)收集副溶血弧菌活菌体0.6-0.8g，用6?8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；
(2)将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3-0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3-0.4mmoI/L的TetA-F、终浓度为0.3?0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3-0.4mmol/L的TetB_F、终浓度为0.3-0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5-0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5-0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05-
0.08U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 TetA-F、TetA-R、TetB-F、Te tB_R、TetD-F 和 TetD-R 分别如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的 10倍母液中包括30?40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01?0.02%甘油和0.05-0.08%硫酸铵，30~40mM MgCl2;
(3)步骤(2)的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。
[0009]在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(I)为:收集副溶血弧菌活菌体0.6?
0.8g，用6?8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000?12000rpm离心10?15min后收集上清液，得到模板。
[0010]在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为0.35mmol/L的TetA-F、终浓度为0.35mmol/L的TetA-R、终浓度为0.35mmol/L的TetB-F、终浓度为0.35mmol/L的TetB-R、终浓度为
0.55mmol/L的TetD-F、终浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。
[0011]在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的 15mMTris-HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸铵，35mM MgCl2o
[0012]在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应条件如下:90?95°C预变性8~12min，然后进入如下循环:94?95 °C变性50?60s、54?55°C退火I?I.2min、72?74 °C延伸45?50s，共30?35个循环，循环结束后于72°C延伸8?1min，2?4°C保存。
[0013]进一步优选的，所述PCR扩增的反应条件如下:93°C预变性1min，然后进入如下循环:94 °C变性60s、54°C退火lmin、74 °C延伸45s，共30个循环，循环结束后于72°C延伸10min，4°C 保存。
[0014]在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)的电泳条件为:2%琼脂糖凝胶，80V电压，时间40min。
[0015]本发明的有益效果是:
1、本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，而不需要经过费时的副溶血弧菌培养阶段；
2、本发明的检测方法在同一反应体系中加入多对引物对多个四环素耐药基因同时进行扩增，在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量;可同时扩增几个目的基因:消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率;可大量地进行样品和目的基因的检测。
[0016]
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例1的电泳检测结果图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019]以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0020]
实施例1
(I )LB培养基摇瓶培养增殖副溶血弧菌，摇瓶培养条件为33°C，24h，120rpm，摇瓶培养结束后离心收集副溶血弧菌活菌体0.8g，用8mL去离子水重悬，反复冻融5次破碎细胞，12000rpm离心I Omin后收集上清液，得到模板；
(2)将该5uL模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R(引物浓度分别为25mmol/L，用ImM Tris-HCl—0.1mM EDTA缓冲液稀释)共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为
0.35mmol/L 的 dNTP、终浓度为 0.35mmol/L 的 TetA-F、终浓度为 0.35mmol/L 的 TetA-R、终浓度为 0.35mmol/L 的 TetB-F、终浓度为 0.35mmol/L 的 TetB-R、终浓度为 0.55mmol/lJ^TetD-Fj#浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQ ID USEQ ID 2^SEQ ID 3^SEQ ID 4^SEQ ID5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01%甘油和 0.06%硫酸铵，35111]\1 MgCl2;
上述PCR扩增的反应体系为50uL，反应条件如下:93°C预变性1min，然后进入如下循环:94 °C变性60s、54°C退火lmin、74 °C延伸45s，共30个循环，循环结束后于72°C延伸10min，4°C 保存；
(3)步骤(2)的PCR扩增结束后，取5uLPCR产物，与IuL Loading buffer混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，电泳结果如图1所示，结果可见450bp左右、650bp左右、550bp左右的条带，分别指示TetA基因、TetB基因、TetD基因。
[0021]同时将经过纯化的PCR产物50uL和20uL三基因的上下游引物一起送深圳华大基因有限公司进行DNA测序。
[0022]以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，SP依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1.一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)收集副溶血弧菌活菌体0.6-0.8g，用6?8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板； (2)将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3-0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3-0.411111101/1的了6七44、终浓度为0.3?0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3-0.4mmol/L的TetB_F、终浓度为0.3-0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5-0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5-0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05-0.08U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 TetA-F、TetA-R、TetB-F、Te tB_R、TetD-F 和 TetD-R 分别如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的 10倍母液中包括30?40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01?0.02%甘油和0.05-0.08%硫酸铵，30~40mM MgCl2; (3)步骤(2)的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。2.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:所述步骤(I)为:收集副溶血弧菌活菌体0.6-0.8g，用6?8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000?12000rpm离心1?15min后收集上清液，得到模板。3.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为 0.35mmol/L 的 TetA-F、终浓度为 0.35mmol/L 的 TetA-R、终浓度为 0.35mmol/lJ^TetB-Fj#浓度为 0.35mmol/L 的 TetB-R、终浓度为 0.55mmol/L 的 TetD-F、终浓度为 0.55mmol/L 的 TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。4.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:所述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸铵，35mM MgCl2。5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件如下:90?95°C预变性8?12min，然后进入如下循环:94?95 °C变性50?60s、54?55°C退火I?1.2min、72?74 °C延伸45?50s，共30~35个循环，循环结束后于72°C延伸8?10111；[11，2~4°(3保存。6.如权利要求5所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件如下:93°C预变性1min，然后进入如下循环:94 °C变性60s、54°C退火Imin、74 °C延伸45s，共30个循环，循环结束后于72°C延伸1min，4°C保存。7.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于:所述步骤(3 )的电泳条件为:2%琼脂糖凝胶，80V电压，时间40min。
【专利摘要】本发明公开了一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，该方法包括如下步骤：（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因进行检测，而不需要经过费时的副溶血弧菌培养阶段。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/02
【公开号】CN105567812
【申请号】CN201511011329
【发明人】黄升谋
【申请人】湖北文理学院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月30日