专利名称：一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学检测领域，具体的说，本发明涉及一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸扩增方法，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增，LAMP反应需要特异性设计2条内引物(FIP和BIP)和2条外引物(F3和B3)，靶DNA在60°C 65°C恒温条件下(如水浴箱内)保温约60min，即可完成LAMP核酸扩增反应。LAMP最终产物包括大量茎环状DNA混合物，由于LAMP扩增产生了巨大数量的DNA产物及焦磷酸根离子，因此焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子反应会生成焦磷酸镁沉淀，故可通过反应管内副产物的浊度或荧光来对产物进行检测。钙黄绿素染色原理是:反应之初钙黄绿素与荧光猝灭剂锰离子结合而不发生荧光，反应管呈橙色；反应开始后，生成的焦磷酸根离子更易于与锰离子结合形成沉淀而释放出游离的钙黄绿素，钙黄绿素与镁离子结合发出绿色荧光，反应管呈绿色。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌,发病率呈世界性分布。主要来自海产品或盐腌溃品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，重症者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。因此，副溶血弧菌是进出口水产品检测的重要项目。
发明内容
本发明的目的 在于提供一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒。本发明目的还在于提供该试剂盒的使用方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:反应混合液，所述反应混合液包含:浓度为0.2μ M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示；浓度为0.2μΜ的外引物Β3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；浓度为1.6μΜ的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示;浓度为1.6 μ M的内引物ΒΙΡ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；浓度为0.8 μ M的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQID NO:5所示；浓度为0.8μ M的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mMpH8.8 Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐温 20、4 至 8mM MgS04、0.8M 甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的钙黄绿素、0.4 至 1.6mM 的 MnCl2 和 0.32U/ μ I 的 BstDNA聚合酶；DNA提取试剂Α，所述DNA提取试剂A为25mM NaOH ；DNA提取试剂B，所述DNA提取试剂B为IM pH8.0 Tris-HCl ；阳性对照:副溶血弧菌DNA。
具体而言，本发明中使用的引物序列如下:外引物F3:5’ -AGCTACTCGAAAGATGATCC-3’B3:5’ -GGTTGTATGAGAAGCGATTG-3’内引物FIP: 5’-ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT-3，BIP:5’-ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG-3’环引物LoopF:ACCAGTAGCCGTCAATGLoopB:TTAGATTTGGCGAACGAGA上述引物例如可以由上海生工生物工程有限公司合成。优选地，本发明所述的试剂盒还包括保护液，所述保护液为液体石蜡。更优选地，所述MgSO4的浓度为8mM。更优选地，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。更优选地，所述MnCl2的浓度为0.4mM。本发明还提供一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤:1)待测样品的DNA模版提取:当所述待测样品为食品时，将所述待测样品加入用于副溶血弧菌增菌培养的APW培养基中进行增菌培养,从而得到增菌液；将200 u L的所述增菌液加入1.5mL的离心管中，在7000g下离心2min，吸弃上清液；然后加入100 y L的DNA提取试剂A，混匀，在98°C下加热IOmin ;接着加入20 y L的DNA提取试剂B，混匀，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版，其中所述DNA提取试剂A为25mM NaOH，所述DNA提取试剂B为IM pH8.0 Tris-HCl ;当所述待测样品为细菌纯培养物时，挑取纯培养加入到含200 ii L无菌去离子水的1.5mL离心管中，在98°C下加热lOmin，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版；2)提供23 y L的反应混合液，所述反应混合液包含:浓度为0.2 y M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；浓度为0.2 ii M的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示；浓度为1.6 ii M的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；浓度为1.6 y M的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；浓度为0.8iiM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；浓度为0.8 ii M的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6 所示；20mM pH8.8 Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐温 20、4 至 8mMMgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的钙黄绿素、0.4 至 1.6mM 的 MnClJP0.32U/U I的Bst DNA聚合酶；3)使2 y L的所述待检DNA模版、阳性对照、阴性对照分别和23 y L的所述反应混合液在64°C恒温反应60min，其中所述阳性对照为副溶血弧菌DNA，阴性对照为制备DNA模版的空白试剂；以及4)分析判断反应产物结果:绿色浑浊表示结果为阳性，橙色澄清表示结果为阴性。优选地，在所述步骤3)的恒温反应之前加入保护液，所述保护液为液体石蜡。液体石蜡浮在反应液的上面，从而避免反应产物从反应容器中溢出以造成相互干扰。更优选地，所述MgSO4的浓度为8mM。更优选地，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。更优选地，所述MnCl2的浓度为0.4mM。常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入1000 X SYBR Green I荧光染料或Gene Finder染料来显色，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境，容易污染环境而造成假阳性，同时SYBR Green I荧光染料或Gene Finder染料还会因为引物二聚体而引起假阳性。因此本发明使用钙黄绿素染色技术替代了 SYBR Green I荧光染料和Gene Finder这些染料，在配置LAMP反应液时就可以加入反应液中，无需LAMP反应后开盖，并且钙黄绿素仅在发生LAMP反应时才显色，避免了 SYBR Green I荧光染料和Gene Finder染料造成的假阳性问题，具有更好的特异性。与传统检测方法相比，本发明所述的方法检测用时短、成本低，结果可直接判定，不需仪器。本发明的试剂盒将所有反应试剂都合并到同一反应液中，使得反应步骤更加简便，试剂盒的结构更为简单。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。在本发明中，除非特别指明，否则使用的菌株如下:副溶血弧菌(ATCC5421，源自中国⑶C营养与食品安全所)实施例1本发明的试剂盒所述试剂盒:包括24个反应管，每管中含有23 y L的反应混合液和30 y L的液体石蜡；I管阳性对照(50iiL) ;2管DNA提取试剂A(1300iiL/管)；1管DNA提取试剂B (600 ii L)。所述反应混合液包含:浓度为0.2 ii M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:I所示；浓度为0.2 ii M的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；浓度为1.6 y M的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；浓度为1.6 y M的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；浓度为0.8 ii M的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；浓度为0.8 ii M的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mM pH8.8 TrisbufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐温20、8mM MgS04、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、
0.08mM的钙黄绿素、0.4mM的MnCl2和0.32U/ U I的Bst DNA聚合酶。所述DNA提取试剂A为25mM NaOH。所述DNA提取试剂B为IM pH8.0 Tris-HCl。阳性对照:副溶血弧菌DNA。实施例2本发明的方法的灵敏度测试APff培养基配制:称取CM401B 3重量％氯化钠碱性蛋白胨水培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司的增菌培养基)9.0g，配置225mL增菌培养基。pH值8.5 ±0.2，121 °C灭菌IOmin,备用。将副溶血弧菌接种到4mL的APW培养基中，37°C过夜培养。将40 ii L的过夜培养菌液接种到另外的新的4mL的APW培养基中，在35°C 150rpm下培养4h，获得中期细胞。然后用生理盐水10倍梯度稀释 法进行稀释，每个浓度的处理都进行三次。选取10_2、10'10_4、10_5、10_6、10_76个稀释度的溶液100 u L，涂布在补充2.5重量％氯化钠的TSA平板(购自北京陆桥技术有限责任公司)上，在37°C孵化过夜。菌落计数结果下表1，10_5菌液中副溶血性弧菌浓度平均值为203cfu/100 u L0表I
权利要求
1.一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 反应混合液，所述反应混合液包含:浓度为0.2μ M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示；浓度为0.2μ M的外引物Β3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；浓度为1.6μ M的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；浓度为1.6 μ M的内引物ΒΙΡ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；浓度为0.8 μ M的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；浓度为0.8 μ M的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mM ρΗ8.8Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐温 20、4 至 8mM MgSO4、0.8M 甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的钙黄绿素、0.4 至 1.6mM 的 MnCl2 和 0.32U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶； DNA提取试剂Α，所述DNA提取试剂A为25mM NaOH ； DNA提取试剂B，所述DNA提取试剂B为IM pH8.0 Tris-HCl ； 阳性对照:副溶血弧菌DNA。
2.根据权 利要求1所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，还包括保护液，所述保 护液为液体石蜡。
3.根据权 利要求1或2所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述MgSO4的浓度为8mM。
4.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
5.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
6.一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤: 1)待测样品的DNA模版提取:当所述待测样品为食品时，将所述待测样品加入用于副溶血弧菌增菌培养的APW培养基中进行增菌培养，从而得到增菌液；将200 μ L的所述增菌液加入1.5mL的离心管中，在7000g下离心2min，吸弃上清液；然后加入100 μ L的DNA提取试剂Α，混匀，在98°C下加热IOmin ;接着加入20 μ L的DNA提取试剂B，混匀，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版，其中所述DNA提取试剂A为25mM NaOH,所述DNA提取试剂B为IM pH8.0 Tris-HCl ;当所述待测样品为细菌纯培养物时，挑取纯培养加入到含.200 μ L无菌去离子水的1.5mL离心管中，在98°C下加热lOmin，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版； 2)提供23μ L的反应混合液，所述反应混合液包含:浓度为0.2 μ M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；浓度为0.2 μ M的外引物Β3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；浓度为1.6 μ M的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；浓度为1.6 μ M的内引物ΒΙΡ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；浓度为0.8μ M的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；浓度为0.8 μ M的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mM pH8.8 Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐温20、4至8mM MgSO4,.0.8M 甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的钙黄绿素、0.4 至 1.6mM 的 MnCl2 和 0.32U/ μ L的Bst DNA聚合酶； 3)使2μ L的所述待检DNA模版、阳性对照、阴性对照分别和23 μ L的所述反应混合液在64°C恒温反应60min，其中所述阳性对照为副溶血弧菌DNA，阴性对照为制备DNA模版的空白试剂；以及 4)分析判断反应产物结果:绿色浑浊表示结果为阳性，橙色澄清表示结果为阴性。
7.根据权利要求6所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，在所述步骤3)的恒温反应之前加入保护液，所述保护液为液体石蜡。
8.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述MgSO4的浓度为8mM。
9.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
10.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述MnCl2的浓·度为0.4mM。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测食品中的副溶血弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括反应混合液，所述反应混合液包含浓度均为0.2μM的外引物F3和外引物B3；浓度均为1.6μM的内引物FIP和内引物BIP；浓度均为0.8μM的环引物LoopF和环引物LoopB；20mM pH8.8 Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；DNA提取试剂A；DNA提取试剂B；阳性对照。本发明还涉及该试剂盒的使用方法。与传统检测方法相比，本发明所述的方法检测用时短、成本低，结果可直接判定，不需仪器。
文档编号C12Q1/68GK103243168SQ20131018045
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月16日 优先权日2013年5月16日
发明者刘鸿君, 王倩, 李力 申请人:汇智泰康生物技术(北京)有限公司