副溶血性弧菌的检测方法

副溶血性弧菌的检测方法
【专利摘要】副溶血性弧菌的检测方法，涉及副溶血性弧菌。用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因。检测方法：副溶血性弧菌模板DNA的提取；外围引物的验证；交叉引物恒温扩增反应体系的建立；交叉引物恒温扩增程序；扩增产物的检测。灵敏度高，是普通PCR的10倍；特异性强，只检出副溶血性弧菌，对其他致病菌检测结果均为阴性；快速检测，检测时间缩短到1.5h，明显提高检测效率；简便实用，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，10～30min即可完成。
【专利说明】副溶血性弧菌的检测方法【技术领域】
[0001]本发明涉及副溶血性弧菌，尤其是涉及一种副溶血性弧菌的检测方法。
【背景技术】[0002]副溶血性弧菌又称嗜盐菌，隶属弧菌科的弧菌属，是一种革兰氏阴性人畜共患菌，广泛分布在近海岸的海水、海底沉积物、海产品及腌制食品中。由该菌引起的食物中毒临床症状多为急性肠炎，表现为腹痛、腹泻、呕吐，其潜伏期一般为8~20h，平均为12h，正常2~3天即可痊愈，愈后良好，少数严重患者可因抢救不及时而死亡。副溶血性弧菌食物中毒与进食含有该菌的食物有关，生食或食入未煮熟的受到污染的海产品或腌制食品是其主要传播途径。已知的重要的传染源有螃蟹、虾、扇贝、牡蛎、蛤类、海蜇、墨鱼、咸菜、腌肉等。副溶血性弧菌的最适生长温度为37°C，因此夏秋季成为副溶血性弧菌食物中毒的高发期，8月为高峰期。近年来由该菌引起的食物中毒事件已跃居我国食物中毒之首，快速简便的检测方法的建立是预防副溶血性弧菌食物中毒的有效途径。
[0003]已建立的副溶血性弧菌的检测方法有传统方法:增菌培养法、最大可能计数法；免疫学方法:酶联免疫吸附法、芯片法、胶体金、免疫传感器、免疫磁珠法；分子生物学方法:常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR、纳米PCR、EMA-PCR法、核酸探针、LAMP法等([I]王国玲，栾玉明，刘达雄，陆家海.副溶血性弧菌检测方法的研究进展[J].中国卫生检验杂志，2010，20(6):1574-1576)。
[0004]交叉引物恒温扩增技术(CPA)是一种新颖的恒温扩增技术，具有较高的特异性和灵敏度，因该方法在恒温下就能发生反应，所以对设备的要求比较低，操作简单，反应只需 60min ([2]Fang RD, Li X, Hu L, et al.Cross-priming amplification forrapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens[J].Journalof C linical Microbiology, 2009, 47(3):847-847 ； [3]Xu GL,Hu L,Zhong HY, etal.Cross priming amplification:mechanism and optimization for isothermal DNAamplification[J].Scientific Reports,2012，2:246.do1: 10.1038/srep00246)。较传统的PCR技术具有高效、快速等优点，尤其适用在基层对副溶血性弧菌进行检测。目前该方法结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌的检测([4]祁军，左峰，刘国红，刘红梅，徐高连，张霞.交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌[J].食品研究开发，2013, 34 (2):67-70； [5]祁军，于智睿，詹曦菁，黄吉城，李智慧.交叉引物等温扩增技术在恶性疟疾快速检测中的应用[J].中国媒介生物学及控制杂志，2013，24(3):204-207)，尚未有用于检测副溶血性弧菌的报道。

【发明内容】

[0005]本发明的第一目的是提供用于副溶血性弧菌检测的特异性引物。
[0006]本发明的第二目的是提供副溶血性弧菌的检测方法。[0007]所述用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；所述副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因，广泛存在副溶血性弧菌中，且具有种特异性；
[0008]所述一对外围引物为:
[0009]正向外围引物VPOF: TGCGAAAGTGCTTGAGAT ；
[0010]反向外围引物VPOR:GATGAGCGGTTGATGTCCo
[0011]所述一对交叉引物为:
[0012]正向交叉引物VPIF:TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ；
[0013]反向交叉引物VPIR:GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG。
[0014]所述一对特异性检测探针为:
[0015]正向特异性检测探针VPDF:CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA，3’端标记异硫氰酸荧光素(Fitc)；
[0016]反向特异性检测探针VPDR:GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC, 5 ’端标记生物素(Biotin)0
[0017]所述副溶血性弧菌的检测方法，包括以下步骤: [0018]I)副溶血性弧菌模板DNA的提取
[0019]利用CTAB/NaCl法(参考微生物学实验(第四版)主编沈萍陈向东)或者细菌基因组DNA提取试剂盒(购于TIANGEN厦门泰京生物技术有限公司)提取副溶血性弧菌的总DNA作为模板；
[0020]2)外围引物的验证
[0021]用一对外围引物VP0F/VP0R对模板进行扩增，扩增后的产物进行质粒克隆得到所需的质粒，通过对质粒进行测序证明:外围引物扩增的片段即为副溶血性弧菌tlh的保守区域核酸序列，说明该外围引物合适，可用于后续交叉引物恒温扩增法实验；
[0022]3)交叉引物恒温扩增反应体系的建立
[0023]20 μ L的恒温反应体系包括:外围引物0.1 μ mol/L、交叉引物0.4 μ mol/L、特异性检测探针 0.3 μ mol/L, dNTPs0.4 μ mol/L, MgS046mmol/L, 10 X Thermopol buffer2 μ L, BstDNA Polymerase (U/ μ L) 8U, Betaine0.5mol/L, DNAl μ L ；
[0024]4)交叉引物恒温扩增程序
[0025]将待反应PCR管放置于微量恒温器中63°C恒温扩增60min，得到扩增产物；
[0026]5)扩增产物的检测
[0027]扩增产物通过商品化的一次性核酸检测试纸条(3号)(购自杭州优思达生物技术有限公司)进行判读，通过观察试纸条检测线和质控线的颜色变化来判断反应是否发生；若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
[0028]与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和实用性:
[0029]①灵敏度高，本发明的灵敏度是普通PCR的10倍；
[0030]②特异性强，本发明只检出副溶血性弧菌，对其他致病菌检测结果均为阴性；
[0031]③快速检测，与传统的检测方法相比，本发明将检测时间缩短到1.5h，明显提高了检测效率；
[0032]④简便实用，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，10~30min即可完成检测结果的判读，尤其适用在基层实用。
【专利附图】

【附图说明】
[0033]图1为交叉引物恒温扩增产物电泳图。在图1中，各标记为，M:100bp laddermarker ；1:副溶血性弧菌CPA扩增产物；2:阴性对照。
[0034]图2为交叉引物法扩增产物的核酸试纸条检测结果图。在图2中，各标记为，1:副溶血性弧菌CPA扩增产物；2:阴性对照
[0035]图3为交叉引物恒温扩增检测副溶血性弧菌特异性电泳图。在图3中，各标记为，M:1OObp ladder marker ；1:阴性对照；2:副溶血性弧菌；3:霍乱弧菌；4:溶藻弧菌；5:仓丨J伤弧菌；6:金黄色葡萄球菌；7:大肠杆菌；8:沙门氏菌。
[0036]图4为交叉引物恒温扩增结合核酸试纸条检测副溶血性弧菌的特异性图。在图4中，各标记为，1:阴性对照；2:副溶血性弧囷；3:霍乱弧囷；4:溶操弧囷；5:创伤弧囷；6:金黄色葡萄球菌；7:大肠杆菌；8:沙门氏菌。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
[0038]实施例1引物的设计与合成
[0039]根据副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因tlh的保守区域设计了两对引物和一对特异性检测探针，序列如下:
[0040]所述一对外围引物为:
[0041 ]正向外围引物 VPOF: TGCGAAAGTGCTTGAGAT ；
[0042]反向外围引物VPOR: GATGAGCGGTTGATGTCC。
[0043]所述一对交叉引物为:
[0044]正向交叉引物VPIF:TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ；
[0045]反向交叉引物VPIR: GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG。
[0046]所述一对特异性检测探针为:
[0047]正向特异性检测探针VPDF:CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA，3’端标记异硫氰酸荧光素(Fitc)；
[0048]反向特异性检测探针VPDR: GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC, 5 ’端标记生物素(Biotin)0
[0049]实施例2CPA方法的建立
[0050]20 μ L的恒温反应体系包括:外围引物0.1 μ mol/L、交叉引物0.4 μ mol/L、特异性检测探针 0.3 μ mol/L, dNTPs0.4 μ mol/L, MgS046mmol/L, 10 X Thermopol buffer2 μ L, BstDNA Polymerase (U/ μ L) 8U, Betaine0.5mol/L, DNAl μ L。
[0051]CPA反应程序:63°C恒温扩增60min。
[0052]扩增产物的检测:扩增结束后取8~10 μ L扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。将试纸条放入含有100 μ L缓冲液的微孔板中。15~30min后即可通过试纸条的显色进行判读。
[0053]实施例3CPA-核酸试纸条法检测特异性
[0054]分别对10株不同的副溶血性弧菌进行检测，结果均为阳性。为了进一步验证其特异性，分别选取霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为对照菌进行测试，结果显示，对照菌结果均为阴性。证明本发明对副溶血性弧菌具有较好的特异性。
[0055]CPA-核酸试纸条检测副溶血性弧菌的灵敏性。通过就平板菌落计数计算出纯培养物的浓度并对其进行10倍梯度稀释，稀释后的培养物用细菌基因组提取试剂盒进行基因组的提取，将提取后的基因组取I μ L用于CPA反应检测该方法的灵敏性。经检测，本发明的最低检测限为5.6Χ 102CFU/mL，其灵敏度是普通PCR的10倍。
【权利要求】
1.用于副溶血性弧菌检测的特异性引物，其特征在于所述用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；所述副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因，广泛存在副溶血性弧菌中，且具有种特异性； 所述一对外围引物为: 正向外围引物 VPOF: TGCGAAAGTGCTTGAGAT ； 反向外围引物 VPOR:GATGAGCGGTTGATGTCC ； 所述一对交叉引物为: 正向交叉引物 VPIF:TTCTGGCGCAGAAGTTAGGTTCATCAAGGCACAAGC ； 反向交叉引物 VPIR:GTTCATCAAGGCACAAGCTTCTGGCGCAGAAGTTAG ； 所述一对特异性检测探针为: 正向特异性检测探针VPDF:CAAAGCGCAAGGTTACAACATCA，3’端标记异硫氰酸荧光素； 反向特异性检测探针VPDR:GAACAAGGCGTGAGTATCAAACAAC，5’端标记生物素。
2.副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤: O副溶血性弧菌模板DNA的提取 利用CTAB/NaCl法或细菌基因组DNA提取试剂盒提取副溶血性弧菌的总DNA作为模板； 2)外围引物的验证 用权利要求1所述一对外围引物VP0F/VP0R对模板进行扩增，扩增后的产物进行质粒克隆得到所需的质粒，通过对质粒进行测序证明:外围引物扩增的片段即为副溶血性弧菌tlh的保守区域核酸序列，说明该外围引物合适，可用于后续交叉引物恒温扩增法实验； 3)交叉引物恒温扩增反应体系的建立 .20 μ L的恒温反应体系包括:外围引物0.1 μ mol/L、交叉引物0.4 μ mol/L、特异性检测探针 0.3 μ mol/L, dNTPs0.4 μ mol/L, MgS046mmol/L, 10 X Thermopol buffer2 μ L, Bst DNAPolymerase (U/ μ L)8U,Betaine0.5mol/L,DNAl μ L ;所述外围引物、交叉引物、特异性检测探针为权利要求1所述外围引物、交叉引物、特异性检测探针； 4)交叉引物恒温扩增程序 将待反应PCR管放置于微量恒温器中63°C恒温扩增60min，得到扩增产物； 5)扩增产物的检测 扩增产物通过商品化的一次性核酸检测试纸条3号进行判读，通过观察试纸条检测线和质控线的颜色变化来判断反应是否发生；若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
【文档编号】C12N15/11GK103667498SQ201310732988
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】刘静雯, 徐苗苗 申请人:集美大学