一种利用分离式生物试剂点阵检测生物分子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，更具体地说，涉及一种利用分离式生物试剂点阵检测生物分子的方法。
【背景技术】
[0002]大量生物试剂的出现，例如成千上万条DNA克隆序列，众多抗体和重组蛋白和数百万个通过化学合成的分子，促进了这些试剂在生物研究、临床诊断和药物开发等方面的应用。生物试剂点阵技术是近来发展较快的应用技术之一。在生物试剂点阵中，每个试剂被放在预先指定的位置上以便之后能通过这个位置来识别它。例如，在一个DNA点阵中(也被称为基因芯片)，多种cDNA或寡核苷酸被固定在载体上，每一个被放在一个预先指定的位置。DNA点阵被用在杂交试验中，来监测大量基因的表达(Schena etal.，Science, 1995，270:467-470 ;DeRisi et al., Nature Genetics, 1996，14:457-460)。
[0003]在一个蛋白点阵(或蛋白芯片)中，多种蛋白被固定在一个支持体上，每一个被放在一个预先指定的位置上。有两种类型的蛋白点阵最为常用:抗体点阵和重组蛋白点阵，它们分别包括大量不同的抗体和重组蛋白。因为抗体点阵能够与细胞中表达的蛋白结合，它们在检测蛋白的体内活性方面极为有用。抗体点阵已被应用在研究在体内蛋白与蛋白相互作用、蛋白翻译后修饰以及蛋白表达(美国专利申请号为US19980126483，公开号为US 6197599B1)。另外，细胞、组织、脂类分子、多肽、药物或其他化学物质组成的点阵能够用在医疗诊断、药物开发、分子生物学、免疫和毒理学等方面进行大规模的筛选检测试验中(Kononen, et al., Nature medicine, 1998, 4:844-847)。
[0004]蛋白质是细胞的重要组成成分，在细胞活动过程中发挥作用。细胞中的蛋白表达种类及数量决定它的形状和功能，异常的蛋白表达会引起疾病。生物医学研究的一个主要任务就是检测生物样品中蛋白的表达模式。由于翻译后修饰，有特定氨基酸一级序列的蛋白质在细胞中可能以不同的形式出现，在许多情况下，只有某些特殊形式的蛋白直接参与细胞某种特定活动，所以检测在细胞中表达的这些特殊形式的蛋白可以对了解细胞的活性和功能提供有价值的信息。蛋白有很多种不同的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和泛昆化。丝氨酸、蛋氨酸或组氨酸残基的磷酸化在信号传导上是一个重要的机制，异常的蛋白磷酸化导致了许多人类疾病。在检测蛋白磷酸化的方法中，经常使用的方法是用放射性同位素代谢标记细胞和用抗体免疫检测，抗磷酸化残基特异抗体，例如PY20和4G10，也经常用来检测磷酸化蛋白。
[0005]检测蛋白质的表达在多个领域有应用，包括生物医学的研究、疾病诊断、寻找治疗指标和药物靶点以及在毒理和药效反映分析方面。在基础生物医学研究方面，经常希望知道哪些蛋白在特殊的细胞或特殊条件下表达，通过比较不同类型细胞的蛋白表达，就可能鉴别哪些蛋白的表达和活性决定一个特殊细胞的性质。在许多信号传导通道中，一些蛋白被特异性地激活，检测这些被激蛋白，例如磷酸化蛋白，会为了解信号传导通道的原理提供关键的信息。许多疾病会改变蛋白的表达模式，而且在许多情况下异常的蛋白表达可以引发疾病。因此，确定蛋白的表达模式以及对比正常和异常细胞的蛋白表达模式对于了解疾病的机理是有用的。检测某些蛋白的表达在临床诊断上也有广泛应用。很多临床检测方法都基于检测样品中的蛋白质标志物，如病毒的抗原和身体里产生的抗体。另外，检测蛋白表达在药物开发领域，例如药物靶作用点的选择，毒理学及寻找药物反应的指标是非常有用的。
[0006]检测蛋白质的方法很多，包括基于抗原-抗体特异性结合的免疫方法和其它非免疫方法。在众多非免疫方法中，质谱是一个比较常用的方法。这一技术是通过将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z)的蛋白质离子分离，收集，确定离子的M/Z值，来分析鉴定蛋白质。质谱技术可以用来鉴定蛋白但不适于定量检测比较蛋白质的表达和一些其它特性，特别是不适于研究细胞内表达高度复杂且高度动态化的蛋白。蛋白质检测的免疫学方法也有很多，有着各自的工作原理、特点和优缺点。研究领域常用的方法有酶联免疫反应(ELISA)、蛋白免疫印迹技术(Western blotting)、免疫化学染色等。疾病检测中还经常用到穿流法(flow through)、侧流免疫层析法(lateralflow immunoassay)等。
[0007]蛋白质点阵技术的出现为大规模检测蛋白质提供了一个有效的方法。根据蛋白点阵的使用模式，可分为二类:捕获式蛋白点阵和分离式蛋白点阵。简单说，捕获式蛋白点阵用来把生物样品中的生物分子捕获到点阵支持体上。而分离式蛋白点阵，一方面可维持蛋白在点阵支持体上的位置；另一方面，当与固定在另一个支持体上的生物分子结合后，蛋白可离开点阵支持体而转移到生物分子支持体上，并且保持每一个蛋白的原有相对位置(Wang, Immunostaining with dissoiable antibody microarrays.Proteomics, 2004, 4, 20-26)。
[0008]抗体点阵是蛋白点阵技术中发展最快的方法，技术上已经日益成熟。抗体点阵可以用来分析样品之间蛋白的差异、确定相应蛋白质的性质、分析细胞提取物或者血清蛋白质混合物。使用捕获式抗体点阵的一般方法是将抗体点阵与溶液中的蛋白样品孵育，使点阵上的抗体与样品中的蛋白(抗原)反应、结合，从而把它们捕获在点阵上；之后，被捕获的蛋白进一步被检测出来。在捕获式蛋白点阵技术中检测被捕获的蛋白的方法有:标记法(tag label-based approach)和非标记法(label-free approach)。在标记法中，蛋白样品首先用一个标记物(生物素、地高辛等)标记，然后与蛋白芯片孵育结合，结合在点阵上的蛋白通过标记来显示。在最常用的双色标记法中(two-color detect1n method)，两个蛋白样品分别用不同颜色的标记物(如Cy3和Cy5)标记，两个样品混合后与一个抗体点阵结合。非标记法类似于酶联免疫法(ELISA)，在这一所谓的‘三明治’方法中(Multiplexsandwich as say)，没有标记的蛋白样品与蛋白点阵结合后，用含有多种抗体的混合物来检测结合在点阵上的蛋白。
[0009]分离式抗体点阵是一种新型的、特殊的抗点阵，它一方面可维持抗体在点阵支持体上的位置；另一方面，当抗体与固定在另一个支持体上的抗原分子结合后，可离开点阵支持体而结合在抗原支持体上(Wang, Immunostaining with dissociable antibodymicroarrays.Proteomics, 2004, 4, 20-26)。分离式抗体点阵的一个重要应用是用来检测生物样品的蛋白。具体方法是，当固定在第一个支持体上的抗体点阵与固定在第二个支持体上的蛋白样品接触时，抗体将与蛋白样品中的对应抗原相结合，第一个支持体与第二个支持体分离后，在适当条件下，与抗原结合的抗体将从第一个支持体上分离而转移到第二个支持体上，被转移到第二个支持体上的抗体的数量与蛋白样品中抗原的数量是成比例的。因此可以通过检测第二个支持体上抗体的数量而得知蛋白样品中抗原的数量。分离式抗体点阵已用来对细胞样品进行免疫染色，检测多种蛋白质分子在细胞中的表达和亚细胞定位图，分析这些蛋白质分子在不同细胞样品中的区别，但是目前关于分离式抗体点阵与生物分子点阵或生物试剂点阵联合使用的研究报道还没有。
【发明内容】
[0010]1.要解决的问题
[0011]针对现有捕获式抗体点阵存在交叉反应(cross-talk)、方法特异性低等问题，本发明提供一种利用分离式生物试剂点阵检测生物分子的方法，同时应用捕获式抗体点阵和分离式抗体点阵来检测多个蛋白质，能同时检测多种蛋白，特别是组织细胞表达的蛋白，避免了交叉反应，从而提高了检测的特异性。
[0012]2.技术方案
[0013]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0014]—种利用分离式生物试剂点阵检测生物分子的方法，其步骤包括:
[0015]a.将生物分子固定在第一个支持体上两个或两个以上的位置，形成一个生物分子点阵；
[0016]b.将分离式生物试剂固定在第二个支持体两个或两个以上的位置，形成一个分离式生物试剂点阵；
[0017]c.将第一个支持体上的生物分子点阵与第二个支持体上的分离式生物试剂点阵接触，在接触过程中，生物试剂与生物分子结合；
[0018]d.将第二个支持体与第一个支持体分离，与生物分子结合的分离式生物试剂与第二个支持体分离，转移到第一个支持体上；
[0019]e.通过检测转移到第一个支持体上的分离式生物试剂，从而检测生物分子。
[0020]一种利用分离式生物试剂点阵检测生物分子的方法，其步骤包括:
[0021]a.将一种或多种捕获式生物试剂分别固定在第一个支持体上，形成一个捕获式生物试剂点阵；
[0022]b.将一种或多种分离式生物试剂分别固定在第二个支持体上，形成一个分离式生物试剂点阵；
[0023]c.将第一个支持体上的捕获式生物试剂点阵与生物样品中的一种或多种生物分子结合，从而把生物分子捕获到第一个支持体上；
[0024]d.然后将第一个支持体与第二个支持体接触，使得固定在第二个支持体上的分离式生物试剂点阵与第一个支持体上的生物分子相接触，分离式生物试剂与第一个支持体上的生物分子相结合；随后将第一个支持体与第二个支持体分离，分离式生物试剂离开第二个支持体而转移到第一个支持体上；
[0025]e.检测第一个支持体上的分离式生物试剂，从而得到生物样品中的生物分子的含量。
[0026]优选地，将所述的步骤d修改为:先将被捕获生