氟苯尼考快速检测试剂盒及其制备、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及氟苯尼考快速检测试剂盒及其制 备、使用方法，属于免疫学领域。
【背景技术】
[0002] 氟苯尼考（Florfenico,FF)中文名称：氟洛芬、氟甲砜霉素，化学名 称：d(+)-苏-1-对甲基苯基_2_二氯乙酰氨基_3_氣丙醇，是二十世纪八十年代后期由美 国Schering-Plough研制成功的一种兽类专用氯霉素类的广谱抗菌药，是第三代氯霉素类 抗生素，该药1990年首次在日本上市，作为新氯霉素的替代品，主要抑制50s亚基的结合从 而抑制细菌肽酰基转氨酶的活性，是新型抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及甲砜霉素耐药 菌的广谱抗生素，可用于治疗猪、牛、禽及水产养殖动物的细菌性疾病。
[0003] 氯霉素（Chloramphenicol,CAP)作为第一代氯霉素类抗生素，其结构上的-N02基 团与抑制造血功能有关，因此CAP具有脊髓造血功能抑制毒性，可引起可逆性的血细胞减 少，引发不可逆再生障碍性贫血的几率为1:30000。FF用-CH3S02基团取代了 -N02基团， 无潜在再生障碍性贫血危险。同时，FF对耐氯霉素和甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP)的耐 药菌株仍有抗菌作用。氟苯尼考作为靶向药物来发挥生物效应，用药剂量小，见效快，半衰 期延长，血药浓度高，可长时间维持血药，广泛用于动物疾病的预防和控制。2000年我国批 准氟苯尼考为国家二类新兽药，在水产养殖上可用于治疗鳗麵爱德华氏病和赤鳍病。
[0004] 在动物体内FF代谢较快，主要代谢产物为氟苯尼考草氨酸、氟苯尼考胺 (Florenicolamine,FFA)、氟苯尼考醇等，但是FFA是大部分可食动物组织中最主要的代谢 产物，因此FFA被作为休药期计算的标志残留物。虽然郭桂芳等认为FF注射液无明显的急 性毒性和亚慢性毒性，但是有研究表明高剂量的FF可以小鼠胸腺、脾脏的重量降低，国外 的研究也表明FF可以抑制小鼠的体液免疫和细胞免疫，这郭桂芳得出的结论相互印证，表 明FF具有较强的免疫毒性。FF在养殖业中的大量应用会导其在动物性食品中的残留，为了 保障公众健康，我国对动物组织中氟苯尼考的最大残留量做了规定，要求的肌肉残留限量 为200yg/Kg、肝脏残留限量为3000yg/Kg、肾脏残留限量为300yg/Kg。
【发明内容】
[0005] 本发明针对氟苯尼考残留的现状，以及其对人体的危害，设计发明提供一种能够 快速、简便、准确、现场检测氟苯尼考和其代谢产物氟苯尼考胺的检测试剂盒及其制备、使 用方法。
[0006] 本发明的技术方案实现如下
[0007] 氟苯尼考快速检测试剂盒，其特殊之处在于包括自下而上排列的支撑体5、用于快 速吸收检测试剂的吸水层3、由硝酸纤维素膜制成的检测层2、带通孔1的盖板4 ;保藏号 为：CCTCC一C201575杂交瘤细胞FFA-C所分泌的、胶体金标记的抗氟苯尼考胺单克隆抗体 C(简称：金标单抗C);A液：含 1-5%PEG20000、0. 05-0. 25%吐温-20 的 0. 01mol/L磷酸盐 缓冲液（PBS) ;B液：含0. 01-0. 25%吐温-20的0.Olmol/L磷酸盐缓冲液（PBS);
[0008] 所述金标单抗C是由碱水解法制备氟苯尼考胺（FFA)半抗原与牛血清白蛋白 (BSA)通过戊二醛法偶联合成氟苯尼考胺-牛血清白蛋白（FFA-BSA)完全抗原，将其作为免 疫原而制备的抗氟苯尼考胺单克隆抗体，经胶体金标记后而致；
[0009] 所述的胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：
[0010] 1、以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为 l〇-20nm；
[0011] 2、将单克隆抗体C(0. 5-lg/L抗体蛋白），按150-500y1加入到上述的100ml胶体 金溶液中，慢搅混匀；
[0012] 3、向混合溶液中加入PEG20000,使其终浓度为1-5%，静置过夜；
[0013] 4、将其离心8000-10000转/分，1-1. 5小时，弃上清；
[0014] 5、取离心沉淀，用含有1-5%?￡620000、0.05-0.25%吐温-20、0.02%叠氮化钠的 0. 01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C;
[0015] 所述磷酸盐缓冲液的PH值为7. 4,其中含有KCI0? 2g、NaCI8. 0g、KH2P040 . 2g、 Na2HP0412H20 2. 9g、蒸馏水 1000ml;
[0016] 所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混勾30-60min。
[0017] 氟苯尼考快速检测试剂盒的使用方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
[0018] 1、取待测溶液5y1，点在盖板4的通孔1中的硝酸纤维素膜上，晾干；
[0019] 2、在其上加含 1-5%PEG20000、0.05-0.25 % 吐温-20 的 0.01mol/LPBS的A液 100y1渗入，进行封闭；
[0020] 3、加入100y1金标单抗C，渗入；
[0021] 4、加入含 0? 05-0. 25%吐温-20 的 0?Olmol/LPBS的B液 100y1 渗入；
[0022] 5、结果显示：硝酸纤维素膜上出现红色斑点为阳性，表示检测到有氟苯尼考或者 氟苯尼考胺残留；无红色斑点为阴性，表示检测不到氟苯尼考或者氟苯尼考胺，或者是两者 浓度低于l〇ug/ml。
[0023] 本发明氟苯尼考快速检测试剂盒检测原理：
[0024] 将待测样品滴加到硝酸纤维素膜上晾干固定，加封闭液A液封闭之后滴加金标单 抗C，金标单抗C特异性和氟苯尼考或氟苯尼考胺进行结合，加洗液B液清洗之后，洗去未结 合的金标抗体，利用胶体金红色颗粒显色原理呈现检测结果，在检测层硝酸纤维素膜上呈 现红色斑点，表示有氟苯尼考或是氟苯尼考胺残留；无红色斑点，表示无氟苯尼考或是氟苯 尼考胺或残留量极低。
[0025] 本发明具有以下优点：
[0026] 1、本发明的氟苯尼考快速检测试剂盒，从实际的养殖需要出发，将药物残留的检 测搬到的养殖现场，使用时无需专门设施和操作技术，适合普通养殖户养殖现场检测，应用 简单。2、具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性，在5-10min之内便 可显示检测结果，一旦检出超标可以将养殖动物多养一段时间，让药物代谢直至残留低于 国家标准，可以安全上市，这是最方便的一种解决药残问题的方法，减少了因药物残留对人 体的伤害和养殖户因药残超标被退货造成巨大的损失，并改善因药残留送检麻烦，周期长， 收费高等原因造成99%以上养殖户在养殖动物上市前是不送检药残留的情况。3、在整个胶 体金标记和试剂盒使用过程中起到防止非特异结合和起到封闭作用的牛血清白蛋白，均以 适当浓度的、分子量为20000的PEG所代替，这样可杜绝因牛血清白蛋白而致的交叉反应， 进一步保证了试剂盒的特异性（因为单克隆抗体制备中免疫原是有牛血清白蛋白为载体 蛋白的）。
【附图说明】
[0027] 图1 :本发明氟苯尼考快速检测试剂盒的结构示意图；
[0028] 图2 :FFA-BSA的紫外特征图谱；
[0029] 图3 :FFA的紫外特征图谱；
[0030] 图4 :BSA的紫外特征图谱；
[0031] 图5 :FFA-BSA、BSA、FFA三组图谱拟合后的紫外特征图谱；
[0032] 图6 :0VA的紫外特征图谱；
[0033] 图7 :FFA-〇VA的紫外特征图谱；
[0034] 图8 :FFA的紫外特征图谱；
[0035] 图9 :FFA-〇VA，OVA，FFA三组图谱拟合后的紫外特征图谱。
[0036] 杂交瘤细胞株FFA-C，其保藏编号为：CCTCC一C201575 ;保藏单位全称及简称： 中国典型培养物保藏中心（CCTCC);保藏单位地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保 藏中心；保藏日期：2015年5月21日。
【具体实施方式】
[0037] 本发明的实施例结合附图进一步描述如下：
[0038] 实施例1
[0039] 氟苯尼考胺的合成：按照摩尔比为1:1，称取FF10. 74g，氢氧化钠2. 56g，加入35ml 蒸馏水溶解，加热搅拌至完全溶解，此时溶液为酒红色澄清，再加入6. 0g氯化钠，搅拌至完 全溶解，冷却后用薄层层析板层析混合液，用碘熏蒸显色，测得Rf?(原点到斑点中心的距离 与原点到溶剂前沿的距离的比值）值与FF不同，证明有FFA生成，将溶液室温放置过夜，用 滤纸过滤、蒸馏水洗涤至流出液体为无色、干燥之后的FFA半抗原，合成路线如下所示：
[0040]
[0041] 实施例2
[0042] 氟苯尼考胺完全抗原的制备：称取25mg氟苯尼考胺溶于2mLN，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中；称量66mgBSA溶解于10mlPH7. 4的PBS缓冲液中；将氟苯尼考胺逐滴加入到上述 BSA溶液中，4°C条件下搅拌，然后逐滴加入100yL戊二醛于