缀合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测领域，特别是涉及一种缀合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 梅毒（syphilis)又称为"霉疮"、"广疮"、"棉花疮"或"杨梅疮"，是一种慢性系统 性传染病，被列为世界三大慢性传染病之一。梅毒病原体是梅毒螺旋体，亦称苍白螺旋体 (Treponemapallidum,TP)，由德国的霍夫曼和谢文定在1905年首次发现。梅毒主要通过性 接触和血液传播，而妇女怀孕时如果感染梅毒，会经由胎盘传染给胎儿，造成先天性梅毒。 梅毒可产生多种多样的症状和体征，早期侵犯生殖器和皮肤，晚期侵犯全身各器官，尤其是 心血管和中枢神经系统，且时隐时显，病程可持续很长，是仅次于艾滋病的严重危害我国人 民身体健康的性传播疾病。据报道全世界每年约有一千二百万例新感染病例，近年来梅毒 发病率在我国也有上升的趋势，据2014年梅毒重点疫情报告，2009年以来梅毒位于乙类传 染病报告发病数的第三，尤其是在产前门诊筛查出的梅毒抗体阳性的孕妇显著增加，给我 国的公共卫生带来危害。但要确实证明感染梅毒并不容易，因为感染早期并无临床症状，潜 伏期在10天至90天，只能靠检测梅毒血清来帮助诊断，目前病人血清中的标志物主要是检 测梅毒螺旋体（TP)抗体。
[0003] 目前，国内外对梅毒的发病机制和诊断方式进行了大量的研究，梅毒的实验室诊 断主要包括：病原学诊断、组织病理学诊断、基因诊断、脑脊液检查及血清学诊断，前四种诊 断方法易受条件制约、临床较少开展。血清学诊断根据使用抗原不同分为两类：非梅毒螺旋 体抗原血清学实验（非特异性TP抗体）和梅毒螺旋体抗原血清学实验（特异性梅毒抗体）， 非梅毒螺旋体抗原血清学试验方法主要包括快速血浆反应素环状卡片试验（RPR)、不加热 血清反应素试验（USR)、研究实验室试验（VDRL)及甲苯胺红不加热血清试验（TRUST)，非梅 毒螺旋体抗原血清学实验的主要缺点是敏感性和特异性不高，许多非梅毒性疾病，包括类 风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性迀延性肝炎等均可呈阳性反应。梅毒螺旋体抗原血清 学试验主要包括：梅毒螺旋体颗粒凝集实验（TPPA)、梅毒螺旋体血球凝集实验（TPHA)、荧 光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)、快速免疫层析试验（RT)、免疫印迹试验（WB)及酶联免 疫吸附试验（ELISA)，其中TPPA、TPHA、FTA-ABS、RT、WB试验虽然可提高检测的特异性，但有 的需制备大量病原体，有的检测成本较高、操作繁琐，且质量难以控制，不利于大规模的血 液筛查工作。因此，研制快速、简便、灵敏且特异的TP体外诊断试剂是当前的主要任务。
[0004] 80年代初，随着分子生物学技术的发展，特别是基因工程（DNA重组）技术的出现 使梅毒螺旋体的研究进入一个新的阶段。酶联免疫吸附试验（ELISA)检测方法应用免疫学 技术测定标本，通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质，是一种敏感的测定的 方法。酶联免疫吸附试验主要采用双抗原夹心法检测梅毒抗体，将检测试剂中的抗原用可 微量测定的物质加以标记，通过标记物将信号放大，得出最终的判定结果。然而检测试剂中 的抗原活性位点容易被标记物包裹，抗原活性位点被包埋将导致抗原活性降低。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种抗原活性位点不容易被标记物包裹的缀合物，以及其制 备方法和应用。
[0006] -种缀合物，包括突变型梅毒检测抗原和标记物，所述突变型梅毒检测抗原由梅 毒螺旋体抗原中间的1或2个赖氨酸突变后得到，所述标记物标记在所述突变型梅毒检测 抗原的N端或C端的赖氨酸位点。
[0007] 在一个实施例中，所述突变型梅毒检测抗原由梅毒螺旋体抗原中间的1或2个赖 氨酸突变为甘氨酸后得到。
[0008] 在一个实施例中，所述突变型梅毒检测抗原包括：
[0009] (a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；
[0010] (b)、与SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸编码得到的多肽；或
[0011] (C)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
[0012] 在一个实施例中，所述标记物为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质和胶体 中的至少一种。
[0013] -种上述缀合物的制备方法，包括如下步骤：
[0014] 步骤一、提供用于表达突变型梅毒检测抗原的基因表达序列，所述突变型梅毒检 测抗原由梅毒螺旋体抗原中间的1或2个赖氨酸突变后得到；
[0015] 步骤二、将所述基因表达序列连接到基因表达载体中；
[0016] 步骤三、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞；
[0017] 步骤四、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表 达液；
[0018] 步骤五、在所述表达液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20%，充分静止后 收集上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为35%，充分静止后收集 沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗产物；
[0019] 步骤六、利用Ni-NTA亲和柱纯化所述粗产物，得到所述突变型梅毒检测抗原；以 及
[0020] 步骤七、对所述突变型梅毒检测抗原进行标记，使得所述标记物标记在所述突变 型梅毒检测抗原的N端或C端的赖氨酸位点，得到所述缀合物。
[0021] 在一个实施例中，所述突变型梅毒检测抗原由梅毒螺旋体抗原中间的1或2个赖 氨酸突变为甘氨酸后得到。
[0022] 在一个实施例中，所述用于表达突变型梅毒检测抗原的基因表达序列包括：
[0023] (a)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列；
[0024] (b)、与SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或
[0025] (c)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得 到的核苷酸序列。
[0026] -种梅毒检测试剂，包括上述的缀合物。
[0027] -种梅毒检测试剂盒，包括上述的梅毒检测试剂。
[0028] 在一个实施例中，还包括包被抗原包被的酶联板、洗涤液、显色液、终止液、样品稀 释液、阴性对照品和阳性标准品；
[0029] 所述包被抗原包括：
[0030](a)、由SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；
[0031] (b)、与SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸编码得到的多肽；或
[0032] (c)、由SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
[0033] 这种缀合物，包括突变型梅毒检测抗原和标记物，通过对梅毒检测抗原基因突变， 使梅毒检测抗原中间的1或2个赖氨酸突变，梅毒检测抗原中间容易与标记物结合的赖氨 酸变成其它的氨基酸，使得标记物标记在突变型梅毒检测抗原的N端或C端的赖氨酸位点， 而不与中间部分的氨基酸结合，从而避免了抗原活性位点被标记物包裹。与传统的试剂相 比，该缀合物的抗原活性位点不会被标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的 抗原活性降低，从而不影响抗原活性，该缀合物用于梅毒检测时，可提高检测的灵敏度和特 异性，并且可以避免前带现象。
【附图说明】
[0034] 图1为一实施方式的缀合物的制备方法的流程图；
[0035] 图2为实施例3中突变型梅毒检测抗原重组质粒的制备过程的示意图。
【具体实施方式】
[0036] 下面主要结合附图及具体实施例对缀合物及其制备方法和应用做进一步的解释 说明。
[0037] 本发明中使用的术语除非另有说明，否则具有以下含义：
[0038] 缀合物
[0039] 本发明中使用的术语"缀合物"包括突变型梅毒检测抗原和标记物，突变型梅毒检 测抗原中间的一个或多个赖氨酸被突变，标记物标记在突变型梅毒检测抗原的N端或C端 的赖氨酸位点。
[0040] 标记物
[0041] 本发明中使用的术语"标记物"是指免疫检测中可被检测到的物质，具体的，标记 物可以为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质、胶体中的至少一种。
[0042] 在传统的免疫检测时，标记物为酶、发光物质、放射性物质等小标记物时，检测抗 原容易被标记物包裹，经常发生抗原表位被包埋而导致抗原活性降低。本发明发现，通过基 因突变，使梅毒检测抗原中间的一个或多个赖氨酸发生改变，可使得标记物标记在抗原的N 端和C端的赖氨酸位点，而不与中间部分的氨基酸结合，可以有效的解决上述问题。
[0043] 因此，本发明提供一种缀合物，包括突变型梅毒检测抗原和标记物，其中，突变型 梅毒检测抗原由梅毒螺旋体抗原中间的1或2个赖氨酸突变后得到，标记物标记在突变型 梅毒检测抗原的N端或C端的赖氣酸位点。
[0044] 梅毒检测抗原由梅毒螺旋体抗原中间的1或2个赖氨酸突变后得到，容易与标记 物结合的赖氨酸变成其它的氨基酸，使得标记物标记在突变型梅毒检测抗原的N端或C端 的赖氨酸位点，而不与中间部分的氨基酸结合，从而避免了抗原活性位点被标记物包裹，进 而提高检测的灵敏度和特异性。
[0045] 具体的，突变型梅毒检测抗原由梅毒螺旋体抗原中间的1或2个赖氨酸突变成甘 氨酸或其他中性氨基酸后得到。
[0046] 在一个实施方式中，突变型梅毒螺旋体抗原由梅毒螺旋体抗原TpNl5的第69位赖 氨酸和第89位赖氨酸突变成甘氨酸得到。突变型梅毒螺旋体抗原采用如下操作制得：PCR 扩增梅毒螺旋体抗原15Kda(TpN15)基因（GeneBankNo:U73115. 1)的24aa~140aa所对 应的DNA区段。采用片段褡裢的方式用两对点突变引物分别突变其中第69位赖氨酸及第 89位赖氨酸，上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点，用BamHI/EcoRI酶切PCR 回收片段，连接到用BamHI和EcoRI双酶切处理之后的表达载体pET-26b(+)中，转化后表 达的蛋白命名为TP049,即突变型梅毒螺旋体抗原。TP049即为由SEQIDNo. 1所示的核苷 酸序列组成的多核苷酸编