一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体检测技术领域，特别是一种白念珠菌抗体的检测试纸。
【背景技术】
[0002] 念珠菌为条件致病性真菌，正常情况下可定植于宿主的皮肤、口腔、上呼吸道、阴 道和肠道等部位，不引起疾病。当某些因素如广谱抗生素大量使用、放疗与化疗、免疫抑制 剂使用等破坏了宿主免疫系统与念珠菌之间的平衡，念珠菌可侵入组织、血液并生长繁殖， 导致宿主的组织损害、器官功能障碍和炎症反应等病理改变，此类感染为侵袭性念珠菌病 (invasivecandidiasis, 1C)，致病菌多为白念珠菌。
[0003] 烯醇化酶（enolase，又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油向 磷酸烯醇式丙酮酸转化，是糖酵解过程的限速酶。一直以来认为该酶是一个古老的、保守 的、功能单一的蛋白，然而随着分子生物学对有免疫原性蛋白的研究日趋发展，发现该酶是 1C血清学检测最重要的靶标分子，检测人血清中抗白念珠菌烯醇化酶抗体（IgG型）并且以 克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病原体抗血清，采用以上技术用于诊断侵袭性念珠菌 病的ELISA方法已被报道，但这一方法存在操作复杂，技术门槛较高的缺点，使其推广和应 用受到一定程度的限制。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种白念珠菌烯醇化酶抗体 的检测试纸，利用重组白念珠菌烯醇化酶蛋白作为抗原制备胶体金免疫层析试纸，用于检 测抗稀醇化酶IgG抗体，能够及时、明确地判断待测样品中是否含有抗白念珠菌稀醇化酶 抗体，并具有特异性、灵敏性高，操作简单快捷的特点。 本发明所述技术问题是以下述技术方案实现的： 一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，它包括依次相互搭接的样品垫、金标垫、醋酸 纤维素膜和吸水垫，醋酸纤维素膜上设有测试带和质控带，所述金标垫包被有金标抗体，测 试带包被有烯醇化酶重组抗原，质控带包被有羊抗小鼠IgG抗体。
[0004] 上述白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，所述金标抗体为在金溶液中加入小鼠抗 人IgG抗体，抗体的终浓度为8ug/ml，制成标金溶液；将标金溶液混合牛血清蛋白后以点膜 浓度l〇ul/cm喷涂金标垫。
[0005] 上述白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，所述羊抗小鼠IgG抗体为在浓度为 0.Olmol/L的PB缓冲液中加入羊抗小鼠IgG抗体，抗体终浓度为1.Omg/ml。
[0006] 上述白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，所述烯醇化酶重组抗原的制备包括步骤 如下： A、重组烯醇化酶蛋白：在白念珠菌烯醇化酶基因的核酸序列中设计引物，以PCR技术 扩增目的基因，扩增产物经纯化后以内切酶进行双酶切，得到重组基因转入表达载体质粒 pET30a，将构建好的表达质粒pET30a-ei?〇l转染感受态细胞，以诱导剂IPTG诱导重组蛋白 表达，经收集纯化得到白念珠菌烯醇化酶重组蛋白； B、制备烯醇化酶蛋白：将步骤A制得的白念珠菌烯醇化酶重组蛋白在室温融化后，经 12000r/min高速离心机离心lOmin，取上清液用0.Olmol/L的PB缓冲液稀释，稀醇化酶蛋 白的终浓度为〇? 8~1. 0mg/ml。
[0007] 本发明采用胶体金免疫层析技术（goldimmunochromagraphyassay，GICA)用重 组的白念珠菌烯醇化酶制备免疫层析检测试纸，可以检测人血清样品中是否存在抗烯醇化 酶IgG抗体，作为筛查和诊断侵袭性念珠菌的辅助指标。用胶体金层析试纸进行检测，操作 简单，诊断速度快，结果清晰易于判断，可直接、定性地检测待测样品中的IgG抗体，无需复 杂的实验技能和特殊设备，同时检测试纸具有试剂稳定、易于保存的特点。这种无创伤、简 易的检测手段可用于临床侵袭性念珠菌高危患者和可疑患者的快速诊断筛查，特别适于在 基层卫生单位和野外条件使用。本发明具有如下突出优点： 1、敏感性好，特异性较高，待测样品如血清或血浆的用量只需i〇〇yL即可进行检测。 利用胶体金层析试纸条对侵袭性念珠菌患者及健康人群的血清样品进行实际检测显示， 在具有统计学意义的条件下，侵袭性念珠菌病患者的检出率可达到65%以上，检测特异性 95%以上。
[0008] 2、操作简便快捷，检测速度快，成本低，可由无专业背景人员直接进行操作，并可 在30分钟内得出检测结果。
[0009] 胶体金免疫层析试纸的测试效果依赖于烯醇化酶蛋白的工作浓度和金标垫的包 被浓度等参数，而且念珠菌为正常的人体寄生菌，健康个体未发生感染时血液中亦存在少 量的抗念珠菌烯醇化酶抗体，而发生感染时，该抗体滴度大幅度升高，因此确定烯醇化酶蛋 白的工作(包被）浓度是层析试纸测试效果的关键参数，过高的工作浓度可引起假阳性率增 高，从健康人血清中检出烯醇化酶抗体；而工作浓度过低可能引起假阴性率增高，无法从念 珠菌感染患者血清中检测出烯醇化酶抗体。本发明经过不断试验反复摸索得出上述关键参 数的浓度范围，从而减少了产生假阳性信号和假阴性信号而造成误判的可能性，提高了测 试的灵敏性和准确度。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明胶体金试纸结构示意图； 图2是本发明白念珠菌烯醇化酶重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳及WB验证图。
[0011] 图中各标号清单为：1、吸水垫，2、硝酸纤维素膜，3、金标垫，4、样品垫，5、样品，6、 测试带，7、质控带。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合附图对本发明作进一步详细说明。 本发明将重组白念珠菌烯醇化酶蛋白为抗原的胶体金免疫层析试纸用于检测烯醇化 酶IgG抗体，制备的过程包括白念珠菌烯醇化酶重组蛋白的获得和胶体金免疫层析试纸的 制备。其中烯醇化酶重组蛋白是通过构建原核表达质粒pET30a_mol、转化并发酵培养、蛋 白纯化而获得的；将纯化的蛋白以磷酸盐缓冲液（PBS)充分透析，用Westernblot分析验 证获得的蛋白与1C小鼠血清发生强烈的免疫反应。在确定重组烯醇化酶蛋白工作浓度、羊 抗小鼠免疫球蛋白的包被浓度及金标垫的包被参数后，制备胶体金免疫层析试纸。
[0013] -、白念珠菌烯醇化酶重组蛋白的获得 1. 1菌株和质粒 菌株：白念珠菌ATCCMYA-2876 (SC5314)，美国标准生物品收藏中心； 质粒：pET30a表达质粒，德国merckmillipore公司； 表达宿主菌：大肠埃希菌AcWiBL21 (DE3)，北京全式金生物公司。
[0014] 1.2引物设计 根据白念珠菌SC5314的烯醇化酶基因序列mol(GenBank登录号：NW_139596)，利用PrimerPremier5. 0软件设计特异性引物，并在引物中加入限制性内切酶酶切位点及若干 保护碱基。
[0015]引物Eno1F:CCGGATCCATGTCTTACGCCACTAAAATC(下划线为内切酶BamHI酶切位 点）， 引物Enol_R:GCCTCGAGTTACAATTGAGAAGCCTTTTG(下划线为内切酶XholI酶切位点）。
[0016] 合成的引物以适量灭菌去离子水溶解，浓度为20mmol/L，-20°C保存备用。
[0017] 1. 3白念珠菌SC5314的培养与基因组DNA提取 将冻存的白念珠菌SC5314经科马嘉真菌鉴定培养基培养后，挑取单个绿色菌落于酵 母膏胨葡萄糖液体培养基（YH)培养基)扩大培养，培养条件为温度35°C，通入5%C02进行培 养12小时。 将扩大培养后的菌液离心，将菌体沉淀以山梨醇缓冲液重新悬浮(重悬)，在室温下孵 育lOmin，离心去上清液。通过溶细胞酶处理后用真菌DNA提取试剂盒（OMEGA公司）提取 白念珠菌DNA。提取方法为：用470ML山梨醇缓冲液重悬沉淀，加入25ML真菌破壁酶(北 京Solarbio公司）和5MLb-巯基乙醇，30°C水浴4h，离心分别收集沉淀，用DNA提取试剂 盒提取DNA。用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度。
[0018] 1. 4聚合酶链式反应（PCR)扩增基因 以提取的白念珠菌DNA为模板，进行PCR扩增(无细胞分子克隆，模拟天然DNA复制的过 程，在体外扩增特异性DNA片段)，得到白念珠菌烯醇化酶的全长基因。PCR反应体系为： 2XPCRmix 25 ML (为DNA聚合酶、dNTP及电泳时所需loadingbuffer的成分） 白念珠菌SC5314DNA 1ML 引物Enol_F(20mmol/L) 1. 5ML 引物Enol_R(2〇mmol/L) 1. 5ML 去离子水 21PL Total volume 50M-L 使用PCRmix反应体系的试剂盒为大连TaKaRa公司Prime-STAR笾MaxDNA polymerasePCRmix，反应参数为 95°C预变性 5min，95°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延 伸lmin，循环30次，最后72°C延伸10min，扩增产物于4°C保存备用，并用琼脂糖凝胶电泳 观察扩增产物（PCR产物）片段长度和纯度。
[0019] 1. 5表达载体pET30a-e/?ol的构建和鉴定 对PCR产物进行回收纯化后，用BamHI内切酶和XhoI内切酶（Fermentas公司）对 pET30a质粒和纯化回收的PCR产物进行双酶切，经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京 天根公司）回收双酶切产物，双酶切产物用T4连接酶（Fermentas公司)连接，转化感受态大 肠埃希菌AcWiBL21 (DE3)。以50Pg/mL卡那霉素LB平板筛选阳性克隆，经PCR与酶 切鉴定后测序。上述DNA的回收、酶切、连接反应、细胞转化和阳性细胞克隆的筛选与鉴定 均参照《分子克隆实验指南》中所述的条件或按照试剂盒制造厂商所建议的条件进行。
[0020] 1. 6Enol重组蛋白的诱导表达纯化、鉴定 诱导：挑取鉴定后含重组质粒pET30a-ei?ol单个菌落，37°C活化过夜。转移至50)^g/mL卡那霉素LB液体培养基中，35°C温度下180rpm震荡培养，待其A600=0. 4~0. 6时，在菌液 中加入的诱导剂0.lmol/LIPTG诱导培养5h，加入的诱导剂终浓度为0. 1mM/L。离心弃上 清液收集菌体。
[0021] 纯化：为保证包被蛋白成分单一，降低非特异性结合，纯化重组烯醇化酶蛋白。将 收集的菌体以1/