专利名称：牛支原体烯醇化酶及其编码基因的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛支原体烯醇化酶及其编码基因的新用途，特别涉及牛支原体烯醇化酶及其编码基因在制备检测纤溶酶原以及检测或诊断牛支原体感染试剂中的用途。本发明属于生物医学领域。
背景技术：
牛支原体(Mycoplasma bovis)属于柔壁菌门柔膜体纲支原体目支原体科支原体属，是牛支原体相关疾病的病原，可引起犊牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和关节炎，是一种重要的呼吸道病原体，目前牛支原体粘附宿主细胞的机制都还不明确。1961年，Hale在美国首次从一例患乳腺炎的牛乳中分离到该病原。目前，在北美洲、欧洲以及亚洲，牛支原体已经成为一种重要的病原菌并在多个国家与地区都有牛支原体相关疾病导致严重了经济损失的报道。2008年，牛支原体首次在我国被分离鉴定，但到现在为止还没有该疾病引起经济损失的统计报道。牛支原体作为一种重要的牛呼吸道疾病的病原菌，有关它的粘附过程、致病机理以及免疫预防已经成为一个新的研究热点。牛支原体通过在牛上呼吸道粘膜的定植，降低机体抵抗力引起其它病原体的继发感染。牛支原体表面没有发现专门的粘附结构，但是在其表面具有一组多变表面脂蛋白。该蛋白家族是多种病原菌的表面免疫相关蛋白，并且在致病菌与宿主细胞的黏附以及侵染宿主的过程中起到重要作用；同时具有很强的免疫原性，能够刺激宿主产生很强的粘膜免疫。 进一步的研究发现在牛支原体表面存在除Vsp蛋白家族之外的粘附因子，例如pMB67、P26 抗原等并推测牛支原体表面存在着其它的粘附相关因子。纤溶酶原及其激活物广泛存在于生物体内是一种92Ku大小的单链糖蛋白，在体外具有真核生物糖蛋白激活活性。该分子的结构包含有一个N端的氨基酸激活区其中包含着一个K5结合区，以及一个丝氨酸蛋白酶活性的区域。纤溶酶原以及它所激活转换成的纤溶酶参与着众多生理以及病理过程例如，纤维蛋白的溶解、周质蛋白溶解、癌细胞的组织侵染过程以及神经元细胞的死亡过程等。众多细菌和支原体在其表面都存在纤溶酶原结合区域结构，使得这些病原体具有了菌体表面相关的水解蛋白能力，而这一能力能够加强其在宿主内的侵染能力与扩散能力。新的研究还表明结合纤溶酶原可以明显加强病原菌粘附宿主细胞的能力。已经有数种纤溶酶原结合受体在细菌及支原体中得到鉴定。
发明内容
本发明在克隆表达牛支原体基因时发现一个表达纤溶酶原结合蛋白的基因，并命名其为P18，该基因表达大小约为67Ku的重组蛋白。测序发现该蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。经序列比对分析证实，该蛋白与牛支原体烯醇化酶(Genebank登录号为YP_004683492. 1)的氨基酸序列具有100%的同源性，因此确定本发明所克隆得到的基因为牛支原体烯醇化酶基因。在体外表达该基因的重组蛋白后，通过western blot分析证明，证实牛支原体烯醇化酶具有良好的免疫活性，可被牛支原体抗体识别，从而可推测该基因可能是一种重要的牛支原体毒力基因。进一步的实验表明，牛支原体烯醇化酶还具有与纤溶酶原的结合活性。在此基础上，本发明人提出了本发明。首先，本发明提出了牛支原体烯醇化酶在制备检测纤溶酶原试剂中的用途，优选的，所述的牛支原体烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有与纤溶酶原结合活性的牛支原体烯醇化酶的蛋白衍生物。在本发明的一个具体实施例中，所述的烯醇化酶含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本发明还提出了编码所述烯醇化酶的基因在制备检测纤溶酶原试剂中的用途，优选的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)编码SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)编码具有与纤溶酶原结合活性的牛支原体烯醇化酶的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物是通过将SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、 缺失或插入而获得的仍具有与纤溶酶原结合活性的牛支原体烯醇化酶的蛋白衍生物。在本发明的一个具体实施例中，所述的基因含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。其次，本发明提出了牛支原体烯醇化酶在制备检测或诊断牛支原体感染试剂中的用途，优选的，所述的牛支原体烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有牛支原体烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。在本发明的一个具体实施例中，所述的烯醇化酶含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本发明还提出了编码所述烯醇化酶的基因在制备检测或诊断牛支原体感染试剂中的用途，优选的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)编码SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)编码具有牛支原体烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物是通过将SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得的仍具有牛支原体烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。在本发明的一个具体实施例中，所述的基因含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。需要说明的是，蛋白质的功能是由氨基酸序列所决定的，但是并不是说一个或几个氨基酸的替换、缺失或插入都必将影响该蛋白质的功能，这一点是本领域技术人员所公知的。在本发明提供的氨基酸序列的基础上本领域技术人员可以通过保守方式替换所述序列的氨基酸而方便地获得本发明蛋白的多种衍生物。例如，可用其他疏水性氨基酸替换序列中的疏水性氨基酸，或用芳香族氨基酸替换其他芳香族氨基酸或用碱性氨基酸替换其他碱性氨基酸等，当然也可通过缺失或插入的方式删除或增加几个或多个氨基酸，只要该获得的蛋白仍具有与本发明所述的蛋白相同的功能则都应该包括在本发明所要求的保护范围之内，其中所述功能包括对支原体抗体的免疫原性和/或与纤溶酶原结合的能力，而不论这种免疫原性和/或与纤溶酶原结合能力强弱大小发生怎样的变化，都应视为具有支原体抗体的免疫原性和/或与纤溶酶原结合的能力。本发明通过原核表达，获得了牛支原体烯醇化酶并通过调整诱导条件成功的可溶性表达了该蛋白，并通过重组牛支原体烯醇化酶与纤溶酶原配体实验以及牛支原体烯醇化酶与牛支原体抗体Western blot实验最终证明该蛋白具有纤溶酶原结合活性与免疫原性， 因此能够用于检测纤溶酶原以及用于检测或诊断由牛支原体引起的感染或疾病。并且也为以后研究牛支原体粘附机制，致病力以及疫苗的研制开辟了新的道路。
图1为牛支原体烯醇化酶基因(P18)的分段PCR扩增片段电泳结果；1 :P18-5/P18-6 引物扩增产物；2 :P18_3/P18_4 引物扩增产物；3 :P18_1/P18_2 引物扩增产物；C 负对照；M =DNA Marker图2为牛支原体烯醇化酶基因(P18)重叠PCR扩增电泳结果；1-2 牛支原体烯醇化酶基因扩增结果；C 负对照；M =DNAMarker图3为表达、纯化重组牛支原体烯醇化酶(P18)电泳结果；1 未诱导的pET_32a/BL21裂解液；2 诱导后的pET_32a/BL21裂解液；3 未诱导的PET-P18/BL21裂解液4 诱导后的pET_P18/BL21裂解液；5_6 纯化后的牛支原体烯醇化酶重组蛋白；M :Protein weight Marker图4为重组牛支原体烯醇化酶(P18)与纤溶酶原配体实验检测结果；1 纯化后的牛支原体烯醇化酶重组蛋白；2 =BSA ；M =Protein weight Marker图5为牛支原体烯醇化酶(P18)与牛支原体抗体Wfestern blot实验检测结果。1 纯化后的牛支原体烯醇化酶重组蛋白；2 :E. coli蛋白；3 =BSA ；M =Protein weight Marker
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1牛支原体烯醇化酶基因(P18)的克隆和表达1、材料1. 1支原体培养牛支原体湖北分离株(HB)由本实验室分离并鉴定(Vassalli J D，Sappino A P, and Belin D. The plasminogen activator/plasmin system[J].J Clin. Invest. 1991. 88 ) :1067-1072)。按照文献(Radaelli Ε, Luini Μ. Bacteriological, serological, pathological and immunohistochemical studies of Mycoplasma bovis respiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter[J], Research in Veterinary Science 2008. 85(2) :282-290.)描述的方法，在含有 20%马血清、10%酵母浸出液以及醋酸铊(0. 125mg/ml)与青霉素QOOIU/ml)的PPLO培养基中扩大培养菌种。 在37. 0°C下培养3 5d后4°C，13000r/min离心30分钟收集菌体，并用PBS冲洗菌体3次。菌体存于-70°C冰箱1. 2主要试剂组织/细胞DNA(小量)抽提试剂盒(上海华舜生物技术公司)；胶回收试剂盒 (上海华舜生物技术公司)；质粒提取试剂盒(omega) ；DAB显色试剂盒(碧云天)；多种 HRP 酶标二抗(Sigma) ；Ni-NTA 树脂(Novagen)；人血纤溶酶原(Sigma) ；rTaq 酶、dNTP、PCR Buffer (宝生物大连公司)。2、方法2. 1、基因组的提取与目的基因的克隆应用组织/细胞DNA抽提试剂盒按照说明书获取基因组。根据本实验室测定的牛支原体湖北分离株(HB)全基因组序列(NC_015725. 1) (Li Y，Zheng H，Liu Y，et al. The Complete Genome Sequence of Mycoplasma bovis Strain Hubei-I[J]. 2011, PLoS ONE 6(6) :e20999.)，针对牛支原体烯醇化酶基因(P18)序列设计引物。由于在大肠杆菌中TGA 编码是终止密码子而在支原体中编码为色氨酸。我们通过重叠PCR的方法设计3対特异性引物将牛支原体烯醇化酶基因(P18)中的TGA突变为TGG。引物信息见表1。反应程序均为95°C 5min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 60s，共 32 个循环；72°C 7min。PCR 产物经的琼脂糖凝胶电泳检测。表1牛支原体烯醇化酶基因(PlS)PCR扩增引物
权利要求
1.牛支原体烯醇化酶在制备检测纤溶酶原试剂中的用途，优选的，所述的牛支原体烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)将SEQID NO :1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有与纤溶酶原结合活性的牛支原体烯醇化酶的蛋白衍生物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的烯醇化酶含有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1所述烯醇化酶的基因在制备检测纤溶酶原试剂中的用途，优选的， 所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)编码SEQID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)编码具有与纤溶酶原结合活性的牛支原体烯醇化酶的蛋白衍生物的核苷酸序列， 该蛋白衍生物是通过将SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得的仍具有与纤溶酶原结合活性的牛支原体烯醇化酶的蛋白衍生物。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于所述的基因含有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
5.牛支原体烯醇化酶在制备检测或诊断牛支原体感染试剂中的用途，优选的，所述的牛支原体烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)将SEQID NO :1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有牛支原体烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的烯醇化酶含有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
7.编码权利要求5所述烯醇化酶的基因在制备检测或诊断牛支原体感染试剂中的用途，优选的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)编码SEQID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)编码具有牛支原体烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物是通过将SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得的仍具有牛支原体烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。
8.按照权利要求7所述的用途，其特征在于所述的基因含有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了牛支原体烯醇化酶及其编码基因的新用途。具体的，本发明公开了牛支原体烯醇化酶及其编码基因在制备检测纤溶酶原以及检测或诊断牛支原体感染试剂中的用途。本发明通过原核表达，获得了烯醇化酶蛋白并通过调整诱导条件成功的可溶性表达了该蛋白，进一步的，通过重组烯醇化酶蛋白与纤溶酶原配体实验以及烯醇化酶蛋白与牛支原体抗体Western blot实验最终证明该蛋白具有纤溶酶原结合活性与免疫原性，因此能够用于检测纤溶酶原以及用于检测或诊断由牛支原体引起的感染或疾病。并且也为以后研究牛支原体粘附机制，致病力以及疫苗的研制开辟了新的道路。
文档编号C12Q1/68GK102533940SQ201210006999
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者刘洋, 李媛, 辛九庆 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司