专利名称：共转染药物代谢酶和转运体的细胞模型的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl细胞模型的构建及用途。
背景技术：
口服给药是临床上最为常用的给药方式之一。口服后药物通常在小肠部位被吸收，透过小肠壁进入人体血液循环，到达靶部位而发挥疗效。小肠是药物吸收进入血液这一过程中主要的生理屏障。新药研发中，候选化合物在小肠中的透过性可影响口服药物的生物利用度，是决定化合物能否成为新药的关键因素之一。目前广泛应用的肠道模型为Caco-2细胞(人结肠癌上皮细胞)，但Caco-2细胞并不能完全模拟人体肠道模型，因为它不能产生粘液且只表达极少量的细胞色素P450酶 (CYP450)。Crespi等用含有人CYP3A4基因的P220. 2载体转染Caco-2细胞，而使其CYP3A4 的表达量比未转染的细胞高100倍。但该细胞系中CYP3A4的活性会在传代过程中以3-4 周为半衰期而丢失。Cynthia Brimer等以pcDNA3. I和pR印10为载体将CYP3A4基因转入 LLC-PKl细胞(猪肾上皮细胞)以获得高表达CYP3A4的细胞系。但LLC-PKl细胞作为肠道体外模型也存在一些缺陷和不足，缺少肠道上重要的转运蛋白。膜转运蛋白对药物的吸收、排泄甚至是代谢，都起着至关重要的作用。它可以保护细胞免受外来毒性物质侵害。1968年，Kessell等首次报导小鼠白血病细胞系中具有多药耐药(MDR)现象。Bielder和Reiehm在1970年就首次提出MDR的概念。1976年， Juliano和Ling在中国仓鼠卵巢细胞突变体细胞膜上发现了一种与MDR有关的糖蛋白，即 P-gp (P-glycoprotein,P-糖蛋白)，Genbank 编号为 NM_000927。P_gp 是一种跨膜糖蛋白， 由mdr基因编码，属于ABC转运蛋白超家族，是具有1280个氨基酸，相对分子量170kDa的膜蛋白。P-gp的二级结构包括12个穿越细胞膜区，2个ATP结合/利用位点。它分为两部分，每一部分均包括6个跨膜螺旋折叠组成的疏水区和一个ATP结合/利用位点的亲水区。 Aller等人在2009年首次P-gp的晶体结构，为转运蛋白的研究跨进很大一步。在人体中， 有外排作用的P-gp由MDRl基因编码。P-gp分布广泛,一般位于小肠、肝细胞、结肠和胆小管等组织的柱上皮细胞，肾脏近端小管的刷状缘，脑部的毛细管内皮细胞。这种极化的定位，有利于它发挥作用，抑制外源物吸收、帮助其消除或者保护敏感组织(如脑或胎儿)与外源物的接触。小肠上存在的多种药物外排蛋白其中最为主要的一种即P-gp。人细胞色素P450 (CYP)是广泛存在于生物体中的一类蛋白超家族，是一种含有铁卟啉辅基的b族细胞色素。CYP450细胞色素超家族中根据同源性不同被划分为多个家族和亚族，其中CYP1A2，2B6，2C9，2D6，和3A4被认为对于大部分药物的代谢相较于其他I相氧化酶贡献最多。人CYP3A家族包括CYP3A4，3A5，3A7，和3A43，其中CYP3A4在肝脏( 40% )和肠道中含量最高，代谢超过50%的临床使用药物。它参与了大多数药物的代谢并导致其首过作用，从而使药物的生物利用度降低，其中CYP3A4为其主要的亚型。。人类的 CYP3A4基因位于第7号染色体q22. 1，包括13个外显子及12个内含子，cDNA长度为1512个碱基，Genbank编号为NM017460。CYP3A4的晶体结构已于2004年得到解析，现在已经得到了 CYP3A4单独和与药物结合的多种晶体结构(蛋白数据库1W0E)。MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞系为马丁达比狗肾上皮细胞发展的一种细胞间连接非常紧密的细胞系，低水平表达转运蛋白，低代谢活性。MDCK细胞被认为是在遗传学方面以及在细胞的脂质、蛋白质组成方面较为理想的上皮细胞系。此外，MDCK细胞很大的一个优点就是培养周期短，只要3 5天即能成熟(Caco-2则要21天)，这样可以大大缩短实验周期，提高效率。Caco-2和MDCK之间有很好的相关性，因此常用MDCK细胞作为肠道模型研究药物在肠道的吸收情况。MDCK-MDR1细胞系是由MDCK细胞稳定转染人源MDRl基因，极性过表达P-gp的细胞系，它所表达的P-gp是位于极性细胞膜的一侧。早在1988年，Pasten等用人类的MDRl基因稳定转染MDCK细胞建立了一个能大量表达P_gp 的细胞系。用MDRl转染MDCK细胞建立的MDCK-MDR1细胞表达产生的P_gp主要是位于单层细胞细胞膜的顶侧，Caco-2和MDCK-MDR1细胞用于药物转运实验所得到的一些参数也比较一致，因此，MDCK-MDR1细胞作为模拟药物肠道吸收模型比MDCK细胞更优越。由于肠道中，除了参与药物转运的P-gp外，还存在参与药物代谢的CYP3A4， MDCK-MDR1细胞只能用于筛选评价药物的吸收特性，不能反映药物在肠道的代谢情况。因此，有必要建立MDRl和CYP3A4的双转染细胞模型，用于筛选和评价药物在肠道的吸收和代谢性质。目前，没有稳定共转染MDRl与CYP3A4的细胞模型，因此将MDRl与CYP3A4共转染至MDCK细胞，获得既稳定高表达P-gp又有高代谢活性的转基因细胞，作为一个更完善的体外肠道模型来研究研究药物的跨膜转运和体外代谢都有重大的研究意义，同时对了解药物在肠道的吸收情况有实际指导作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl的细胞模型的构建方法，主要是先将P-gp的基因MDRl克隆到pcDNA3. I (+) (invitrogen)上，转染MDCK 细胞(ATCC)，经过G418筛选出单克隆细胞，得到MDCK-MDR1细胞株，然后将CYP3A4克隆到带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3. I (+) /Hygro (invitrogen)上,转染MDCK-MDR1细胞， 经过潮霉素B筛选，得到共转染CYP3A4和MDRl细胞。犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4目前已由中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏；地址中国武汉武汉大学；保藏日期2011 年12月15日；培养物名称犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏编号为=CCTCC C2011119。本发明的共转染CYP3A4和MDRl细胞模型通过以下方法构建(I)将MDCK细胞以IO5/孔种于六孔板，培养48小时，用Lipofectamine 2000试剂(invitrogen)将表达载体pcDNA3. I (+)/MDRl转染MDCK细胞，方法参考转染试剂说明书，转染24小时后换液，并加G418进行筛选，以浓度600ug/mL筛选96小时后升至800ug/ mL筛选24小时，(2)将存活的细胞转移至培养瓶内培养，以600ug/mL的浓度培养二十天左右，按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆，通过在mRNA，蛋白等水平检测，筛选出活性较高的MDCK-MDR1细胞，(3)将MDCK-MDR1细胞以相同的密度种植于6孔板中，当细胞达50-70%汇合时进行转染,使用Lipofectamine LTX转染试剂(invitrogen)将表达载体 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4转染至MDCK-MDR1细胞，方法参考转染试剂说明书，转染6小时后换含10% FBS的DMEM培养基，培养24小时后将培养基换成400ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基，(5)隔一天换新鲜的含400ug/mL潮霉素B和10 % FBS的DMEM培养基，筛选14天左右将存活的细胞按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆MDCK-MDR1/ CYP3A4 细胞。在步骤(2)中，在mRNA水平验证MDRl基因转录水平，采用的引物序列分别为MDRl 5’ -CCCATCATTGCATATGCAGG-3 ’5’ -GTTCAAACTTCTACTCCTGA-3’β-actin 5，-CCCCTGAATCCCAAAGCC-3 ’5’ -GATGTCACGCACGATCTCCC-3。在步骤(3)中，构建表达载体pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4中CYP3A4的引物序列为5，-CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3，5， -ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTGC-3，。本发明的另一个目的是提供所述共转染细胞模型在P-gp和CYP3A4共同底物初步筛选中的应用，所述筛选可以模拟药物在肠道中的吸收和代谢过程。本发明提供的双转染CYP3A4和MDRl的MDCK细胞株与已报道的Caco_2/CYP3A4 细胞株比较，具有(1)本发明构建的转基因细胞MDCK-MDR1/CYP3A4细胞稳定表达P-gp和 CYP3A4蛋白，而部分报道的经诱导或瞬时转染得到高表达CYP3A4的细胞，多次传代后高表达性状会消失，而MDCK-MDR1/CYP3A4细胞多次传代后还将保持高表达的特征；(2)本发明构建的转基因细胞MDCK-MDR1/CYP3A4细胞与已报道的Caco_2/CYP3A4细胞相比，培养周期短，且细胞较之Caco-2细胞更易于培养；Caco-2细胞中含有多种转运蛋白，而MDCK-MDR1 细胞含单一的转运蛋白P-gp，因此MDCK-MDR1/CYP3A4细胞对于研究药物的吸收外排机理方面更有优势；(3)有研究报道构建的LLC-PK1/CYP3A4细胞作为肠道模型，缺乏肠道上重要的转运蛋白。而本发明构建的MDCK-MDR1/CYP3A4细胞共转染转运蛋白与代谢酶，作为模拟肠道的体外模型更为优越。本发明提到的双转染细胞模型可以用来模拟药物载肠道的吸收和代谢过程，进而初步筛选P-gp和CYP3A4共同底物。
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图况。
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质粒pcDNA3. I (+)/MDRl的鉴定电泳图。质粒 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4 连接电泳图。
;根据Rhol23细胞内积聚量筛选MDCK-MDR1单克隆的结果图。
6ffestern blotting 检测 MDCK-MDR1/CYP3A4 细胞中 CYP3A4 的表达量。
7底物BFC在MDCK-MDR1/CYP3A4单克隆细胞株中的代谢活性及抑制剂作用情
8底物睾酮在MDCK-MDR1/CYP3A4单克隆细胞株中的代谢情况。
9底物咪达唑仑在MDCK-MDR1/CYP3A4单克隆细胞株中的代谢情况。
10MTT实验测定环磷酰胺对四种细胞的毒性结果。
IlMTT实验测定GA(17:1)对三种细胞的毒性结果，根据IC50值筛选P-gp和CYP3A4的底物。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。通过下列实施例对本发明的技术特征做详细的描述，但不限制本发明。实施例I表达质粒pcDNA3. I (+) /MDRl 的鉴定及 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4 重组质粒的构建质粒pcDNA3. I (+) /MDRl作为表达载体，用感受态细菌E. coli DH 5 α扩增质粒， QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取纯化质粒，EcoR I酶切鉴定，并对质粒pcDNA3. I (+) / MDRl中的MDRl全长进行DNA序列测定。设计含Kpn I、Xho I酶切位点的PCR引物，上下游引物序列分别为 5’ -CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3’ ；5’ -ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTGC-3’。从本实验室基因库中钓取CYP3A4基因，T-A连接至pMD19_T Vector,经转化、挑菌、摇菌、提取质粒后进行酶切鉴定及测序鉴定。Kpn I, Xho I双酶切pMD9-T/CYP3A4，得到带粘性末端的CYP3A4 cDNA，将其与Kpn I、Xho I双酶切后得到的pcDNA3. I (+)/Hygro 载体连接，经转化、挑菌、摇菌、提取质粒、酶切鉴定后进行连接区域DNA测序，从而构建出 pcDNA3. I (+) /Hygro/CYP3A4 表达载体。表达载体pcDNA3. I (+) /MDRl电泳得9. 9kb条带，用EcoR I酶切鉴定，得I. 2kb、
3.3kb、5. 4kb条带(结果参见图I)通过DNA测序发现，在表达载体中MDRl基因全长无有意义的碱基突变。重组质粒pcDNA3. I (+)/Hygro进行Xho I、Kpn I双酶切鉴定正确(结果参见图2)，挑选b号和d号进行测序鉴定，鉴定正确后-80°C保持以备后续实验使用。 图 I 中，A-质粒 pcDNA3. I (+)/MDRl 电泳图，I 和 2 为 pcDNA3. I (+)/MDRl,大小是 9900bp ； B-质粒pcDNA3. I (+) /MDRl经EcoRI酶切鉴定图，1、2和3为三个样品酶切条带，大小分别是 5400bp、3300bp、1200bp。图 2 中，1-5 pcDNA3. I (+)/Hygro/CYP3A4 双酶切电泳图(KpnI, XhoI) ；6 pcDNA3. 1(+)双酶切电泳图(KpnI、XhoI)。实施例2 MDCK细胞转染及功能鉴定将MDCK细胞以IO5/孔种于六孔板，培养48小时。用Lipofectamine 2000试剂将表达载体pcDNA3. I (+) /MDRl转染进MDCK细胞内，方法参考转染试剂说明书。转染24小时后换液，并加G418进行筛选，以浓度600 μ g/ml筛选96小时后升至800 μ g/ml筛选24小时。然后将存活的细胞转移至培养瓶内培养，以600 μ g/ml的浓度培养二十天左右。按有限稀释法接种于96孔板，获得19个抗性单克隆，为MDCK-MDR1细胞，分别以小写字母a s命名。l.Rhol23在细胞内的积聚MDCK和MDCK-MDR1细胞以2X IO5/孔种于24孔板，48小时后，加入含4μ mol/L Rho123的DMEM完全培养液，孵育lOOmin，吸弃上清，用冰冷的PBS洗3次，吸净剩余的PBS， 每孔加O. 25ml O. 2mol/L NaOH裂解细胞，IOmin后加O. 25ml O. 2mol/L HCl中和，反复吹打混匀，收集裂解液于离心管中。13000rpm离心lOmin，取上清200 μ I在激发波长485nm、发射波长530nm处检测荧光强度，用BCA蛋白试剂盒检测每个样品的总蛋白量。在P_gp抑制剂对MDCK-MDR1细胞内积聚影响的研究中，在加入Rhol23之前先加入含O. lmmol/L维拉帕米的DMEM完全培养液预孵育lOmin，然后弃孵育液，加入含O. lmmol/L维拉帕米的4mol/L Rho 123孵育2h，其他步骤同上所述。每个样品以所测得细胞内药物Rhol23的量(RFU relative fluorescence units)除以总蛋白量(g)来表示其在细胞内的积聚量，以RFu/g表示。以MDCKKFU/g与MDCK_MDRlKFU/g的比值表征细胞对Rhol23的外排能力，比值越大说明细胞对 Rhol23的外排能力越强。用P-gp的抑制剂维拉帕米和Rhol23共孵育后，对其外排也有明显的抑制作用(结果参见图3)。图3中，C为MDCK细胞Rhol23摄取量作阴性对照组，在 IOOmin的摄取实验中以对照组(37. 26 ±4. 82) RFU/g的绝对值作为相对量1，1-17为抗性单克隆细胞株，林*P < O. 001，**P < O. 01，与阴性对照组相比;_P < O. 001**P < O. 01，药物组与抑制剂组相比。通过统计学分析，由结果可看出单克隆株a、b、d、f、h、j、m、q、s对Rhol23有明显的外排作用，且它们和对照之间的差异有统计学意义，此外在P-gp抑制剂存在的条件下， 单克隆株a、b、d、f、h、j、q、s外排作用显著减弱，与单克隆株Rhol23孵育后细胞内的积聚量进行比较，也有显著的统计学差异，进一步证明外排作用是P-gp所引起的，且蛋白表达水平及活性上有很大的差异。2. RT-PCR 检测 mRNA 的表达使用Trizol提取MDCK和MDCK-MDR1细胞的mRNA，cDNA合成反应体系以及PCR反应体系如下(表I和表2)表I. cDNA合成反应体系RNA 模板3 μ gOligo (dT) 18O. 5 μ g经DEPC 处理的水 to 11 μ I70°C孵育5min，然后置于4°C 5min后加入37°C孵育 5min 后加入 200units 的 M-MuLv Reverse Transcriptase lul,42°C孵育60min后，70°C孵育lOmin，最后置于4°C。表2. PCR 反应体系(25 μ I)
5 X缓冲液
4μ1
2μ1
0.5μ1 (40υ/μ1) to 19μ1
IOmMdNTP RNase 抑制剂 C20U)
经DEPC处理的水
cDNA
Taq DNA聚合酶
PCR反应缓冲液
2μ1
0.5μ1
MgCl2
H2O
引物
21.5μ1
2μ1
15.5μ1
2μ1
PCR反应条件94°C下初次变性3min，然后进行30个循环的反应(94°C 30s，56°C 下退火30s，72°C延伸35s)，72°C lOmin。选用β-actin为内参基因，使用Primer 5. O进行引物设计如下(表3):表3.弓I物序列，扩增条带大小和PCR反应条件
权利要求
1.一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl细胞模型，通过以下构建步骤实现(1)将MDCK细胞以IO5/孔种于六孔板，培养48小时，用Lipofectamine 2000试剂将表达载体pcDNA3. I (+) / MDRl转染MDCK细胞，方法参照转染试剂说明书，转染24小时后换液，并加G418进行筛选，以浓度600ug / mL筛选96小时后升至800ug / mL筛选24 小时；(2)将存活的细胞转移至培养瓶内培养，以600ug/ mL的浓度培养二十天左右，按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆，通过在mRNA，蛋白等水平检测，筛选出活性较高的 MDCK-MDR1 细胞；(3)将MDCK-MDR1细胞以相同的密度种植于6孔板中，当细胞达50-70%汇合时进行转染，使用Lipofectamine LTX转染试剂将表达载体pcDNA3. I (+)/Hygro/CYP3A4转染至 MDCK-MDR1细胞，方法参照转染试剂说明书，转染6小时后换含10%FBS的DMEM培养基，培养 24小时后将培养基换成400 ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基；(5)隔一天换新鲜的含400 ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基，筛选14天左右将存活的细胞按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆MDCK-MDR1/CYP3A4细胞，由中国典型培养物保藏中心保藏；地址中国武汉武汉大学；保藏日期2011年12月15日； 培养物名称犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏编号为CCTCC C2011119。
2.根据权利要求I所述的一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl细胞模型，其特征在于，步骤(2)中，在mRNA水平验证基因转录水平，采用的引物序列分别为MDRl 5’ - CCCjKrCATTGCjATATGCAGG-S'5’- GTTCAAACTTCTACTCCTGA-S1β-actin 5'- CCCCTGAATCCCAAAGCC-3'。5’- GATGTCACGCACGATCTCCC-3
3.根据权利要求I所述的一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl细胞模型，其特征在于，步骤(3)中，构建表达载体pcDNA3. l(+)/Hygro/CYP3A4中CYP3A4的引物序列为 5’-CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3’ ；5’-ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCC ACTTACGGTGC-3’。
4.根据权利要求I所述的一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDRl细胞模型在 P-gp和CYP3A4共同底物筛选中的应用。
全文摘要
本发明提供一种共转染CYP3A4和MDR1细胞模型的构建，是先将P-gp的基因克隆到pcDNA3.1(+)上，转染MDCK细胞，经过G418筛选出单克隆细胞，得到MDCK-MDR1细胞株，然后将CYP3A4克隆到带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1(+)/Hygro上，转染MDCK-MDR1细胞，经过潮霉素B筛选，得到共转染CYP3A4和MDR1细胞。MDCK-MDR1/CYP3A4被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCC2011119，保藏日期2011年12月15日。本发明构建的模型，可用于模拟药物载肠道的吸收和代谢过程，进而筛选P-gp和CYP3A4共同底物。
文档编号C12Q1/02GK102586191SQ201210006590
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者何新, 余露山, 刘瑶, 周慧, 徐思云, 曾苏, 王鹭, 胡海红, 蒋惠娣 申请人:浙江大学