专利名称：含有cd34标志基因用于转染细胞分选的载体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体的说是一种含有CD34细胞表面标志基因用于转染细胞分选的载体的构建方法及其应用。
背景技术：
在基因工程中，将外源基因通过载体携带入宿主细胞，并在宿主细胞中进行扩增使外源基因得以高效表达的技术有着十分广泛的应用。但是在将载体转染细胞后，如何从数量巨大的细胞群中检测并分选出为数极少的转化细胞，就成为建立真核细胞表达系统的一个关键。
目前所用的方法通常为利用载体中携带的标记基因，通过在培养基中加入相应的抗性药物或通过其他方式来进行筛选，最常用的为G418(geneticin)筛选。G418对真核细胞具有毒性，但当载体中携带的新霉素抗性基因(neo)在真核细胞中表达时，可产生一种磷酸转移酶，使得G418失活，从而转染进载体并表达了新霉素抗性基因的细胞即可避免被杀死。此外还有胸苷激酶基因(tk)选择系统、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)检测系统等方法，但是由于转染细胞中标志基因与目的基因并不一定同时表达，因此通过这类方法对转染细胞进行筛选时，既耗时效率又低，要分选出表达了目的基因的细胞株通常需耗费一个甚至几个月的时间。
有些情况下还可以利用转染细胞所获得的某些特性通过流式细胞仪来进行分选，但是流式分选所需费用较高，使其推广应用受到限制。
近年来，通过免疫学的方法，即利用细胞表面的某些标志分子通过抗原-抗体结合反应分选某种类型的细胞的方法在生物医学科研及临床研究中有着广泛的应用，例如利用免疫磁珠法(MACS)分离CD34+造血干/祖细胞等等。我们将免疫学的细胞分选方法与多基因共表达载体的构建策略相结合并应用于转染细胞的分选，不仅简化了传统的转染细胞分选烦琐又耗时的过程，而且提高了转染细胞的分选效率。
在细胞表面标志基因的选择中，CD34基因因其显著的优点而受到了我们的关注。目前，对于CD34+细胞的分选已有十分成熟的方法，而且有许多商品化的试剂及设备，可以方便、高效地分选CD34+细胞。我们通过在转入目的基因的时，将标志基因CD34一起转入细胞，使转染细胞表达目的基因的同时亦获得CD34表面标志，从而利用CD34表面标志，方便的分选转染细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于转染细胞分选的载体。其特征在于，载体中包含编码细胞表面分子CD34的核苷酸序列，将目的核苷酸序列插入该载体多克隆位点后经转染细胞，两者可以实现共同表达，通过转染细胞所新获得的CD34表面标志分子利用免疫结合的原理实现分选阳性细胞的目的。
采用多基因共表达载体的构建方式，实现CD34基因和目的核苷酸序列两者的共同表达。凡是可以实现两个或者多个不同基因共同表达的载体构建策略均可以应用于此，目前较常用的为构建双顺反子载体，两个基因之间以一定的核苷酸序列进行连接，实现其共同表达，例如以IRES(internal ribosome entry site)、2A等序列将两个基因进行连接的构建方法。我们利用IRES序列，来构建双顺反子载体。
经本发明中所述的载体转染细胞后，在表达目的基因的同时，转染细胞可获得一种新的细胞表面标志CD34。利用此种细胞表面标志，采用免疫学的方法，将一定的标志物(例如免疫磁珠)结合于细胞表面上，然后即可通过相应的细胞分选技术(例如免疫磁性分选)来实现转染细胞的分选。
我们构建的这一载体提供了一种新的分选转染细胞的思路和方法，简化了以往烦琐的转染细胞分选过程，提高了转染细胞的分选效率，在生物医学领域具有极佳的应用前景。
下面以质粒载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的构建为例，并结合附图对本发明做一详细说明。
图1是质粒载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的构建流程图。
图2是质粒载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的PCR鉴定。
MDL2000分子量标志物；1pcDNA3.1(+)-IRES-CD34经PCR扩增IRES的部分序列；2pcDNA3.1(+)-IRES-CD34经PCR扩增CD34序列；图3是质粒载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的酶切鉴定。
M1DL2000分子量标志物；M2DL15000分子量标志物；1pcDNA3.1(+)-IRES-CD34经HindIII单酶消化。
2pcDNA3.1(+)-IRES-CD34经EcoRI、XbaI双酶消化。
图4是质粒载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的图谱。
具体实施例方式
实施例1、pcDNA3.1(+)-IRES-CD34载体的构建一、CD34-cDNA插入T-easy载体。CD34基因分离自CD34+细胞，根据CD34-cDNA编码区的序列并分别引入NcoI和XbaI、SphI酶切位点合成引物，引物序列及其多聚酶链式反应(PCR)的条件如下P15′-CGCCCATGGTGCTGGTCCGCAGGGGC-3′P25′-CGCGCATGCTCTAGATTAGCGGCGATTCATCAGGAA-3′50μl反应体系包括2ul cDNA，primer1和2各2μl(10μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl高保真Taq DNA聚合酶(BioDev公司)，5μl 10×PCR Buffer，34.5μl灭菌水。反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 80sec，33个循环；72℃ 10min。反应产物克隆至pGEM-T easy载体(Promega公司，美国)，获得克隆质粒T-CD34。
二、IRES(EMCV)插入T-CD34。质粒pIRES2-EGFP用限制性内切酶NcoI、SalI消化，回收目的片段IRES插入到T-CD34载体的NcoI、SalI位点上，获得携带IRES和标志基因CD34的载体T-IRES-CD34，经SalI、XbaI双酶消化后，TAE琼脂糖凝胶电泳得到1.6kb的条带，与预期结果符合。
三、pcDNA3.1(+)-IRES-CD34载体的构建。用SalI、XbaI双限制酶消化T-IRES-CD34载体，获得IRES-CD34片段，插入经XhoI、XbaI双限制酶消化的pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点。经EcoRI、XbaI双酶消化后，获得1.6kb条带，与预期结果符合；经HindIII单酶消化后，获得300bp条带，与预期结果符合。经PCR鉴定，CD34为阳性。设计引物鉴定IRES如下P15′-CGGTGGGAGGTCTATATAAGC-3′P25′-TTATTCCAAGCGGCTTCG-3′。
20μl反应体系包括1μl质粒，primer1和2各1μl(10μM)，2μl dNTP(2.5mM)，0.2μl rTaq酶(TakaRa公司)，2μl 10×PCR Buffer，12.8μl灭菌水。反应条件为94℃变性5min；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7min。IRES鉴定结果为阳性。对其进行测序及分析表明，载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34构建成功。
本实施例是构建了含有细胞表面标志基因CD34的双顺反子载体，采用脑心肌炎病毒EMCV的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)序列进行连接，以实现目的基因和细胞表面标志基因的共同表达。
实施例2、重组载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc的构建设计引物从载体pAP1-luc上扩增luc基因，并引入NheI、EcoRI酶切位点，引物序列及其多聚酶链式反应(PCR)如下P15′-GCTAGCATGGAAGACGCCAAAAACA-3′P25′-GAATTCAATTACACGGCGATCTTTCC-3′。
50μl反应体系包括2μl质粒，primer1和2各2μl(10μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.3μl Pyrobest Taq酶(TakaRa公司)，5μl 10×pyrobest Buffer，34.7μl灭菌水。反应条件为94℃变性5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s，33个循环；72℃ 10min。反应产物克隆至pGEM-T easy载体(Promega公司，美国)，获得克隆质粒T-luc。
用NheI、EcoRI双限制酶消化质粒T-luc，得到的目的基因luc片段(约1650bp)插入经NheI、EcoRI双限制酶消化的3.1-IRES-CD34载体的多克隆位点。经PCR鉴定、酶切鉴定正确后，对其进行序列测定。得到重组载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc。
实施例3、重组载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc转染细胞生长状态良好的CHO细胞常规培养至50％～75％汇合，用胰酶消化收集细胞，用预冷的电穿孔缓冲液冲洗两次，然后将细胞重新悬浮在该缓冲液中，使细胞的终浓度为(0.5-1.0)×107个细胞/ml。取0.8ml细胞悬液放入电转杯中，加入适量的重组载体pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc并充分混合，冰浴中放置10min，电击一次。电击后将电转杯放入冰浴中10min。用适当的完全培养基稀释细胞，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。
实施例4、运用MACS系统分选转染细胞转化后细胞常规培养24～48小时，使转化的外源基因得以表达。弃去旧培养基，加入胰酶消化液消化，轻轻吸出消化液，加入10ml PBS(含2mM EDTA)轻轻吹吸，转移入离心管中离心(800g，10min)收集细胞，用10mlPBS(含2mM EDTA)洗一次，之后采用Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec)利用免疫磁珠分选(MACS)的方法对其进行分选。分选得到的细胞可直接进行下一步的分析或者加入培养基后继续培养。
采用本发明中的载体与常规载体相比，可以大大提高转染细胞分选效率，缩短转染细胞分选的周期。
权利要求
1.一种含有CD34标志基因用于转染细胞分选的新载体，其特征在于载体中包含一段编码细胞表面分子CD34的核苷酸序列，将目的核苷酸序列插入该载体的多克隆位点后经转染细胞，可以实现目的核苷酸序列和CD34基因的共同表达。
2.根据权利要求1所述的载体的构建方法，其特征在于采用多基因共表达载体的构建方式来实现目的核苷酸序列和CD34基因两者的共同表达。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于可采用双顺反子载体的构建方法构建。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于可采用多启动子载体的构建方法构建。
5.权利要求1所述的载体在转染细胞分选中的应用，即利用转染细胞在表达目的核苷酸的同时所新获得的CD34细胞表面标志而对目的细胞进行分选。
6.根据权利要求5所述的转染细胞的分选方法，其特征在于利用免疫结合的原理而进行的分选，可采用的方法包括免疫磁珠分离、免疫吸附法分离等。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体的说是一种含有CD34标志基因用于转染细胞分选的载体的构建方法及其应用。本发明构建了包含有编码细胞表面分子CD34的核苷酸序列的载体，采用了多基因共表达载体的构建方式，将目的核苷酸序列插入该载体多克隆位点后转染细胞，载体中CD34基因和目的核苷酸序列可实现共同表达。利用转染细胞获得的新的细胞表面标志，采用免疫结合的原理来实现分选阳性细胞的目的。本发明提供了一种新的分选转染细胞的方法，不仅简化了传统的转染细胞分选烦琐又耗时的过程，而且提高了转染细胞的分选效率，在生物医学领域具有极佳的应用前景。
文档编号C12N15/65GK1712535SQ200410049999
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者裴雪涛, 岳 文, 曲笑霞, 秦立篷, 高艳红, 闫舫 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所