专利名称：Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途的制作方法
技术领域：
:本发明属于分子生物学领域，涉及Grp75基因新的用途，具体涉及应用基因转染技术Grp75在制备治疗肝细胞氧化损伤和肝脏纤维化药物中的用途。
背景技术：
:肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织增生与沉积。现代研究表明，常见多发的急，慢性肝病例如病毒型肝炎，脂肪肝，酒精肝等大部分病例在早期均表现为肝纤维化，如果不能及时发现并有效抑制，将可能进一步发展成为肝硬化乃至肝癌，直接危及患者生命。据研究显示，正常肝细胞损伤被视为激活肝纤维化的最初信号，随着肝细胞的持续受损，凋亡，肝纤维化将不断加剧。因此，阻止或者延缓肝纤维化的发生，预期可治愈多数慢性肝病。研究报道，肝细胞的 氧化损伤的发生是肝纤维化的早期的病理过程，肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织增生导致的慢性疾病，在肝纤维化的病理过程中，肝星形细胞的激活，是其显著的特征，而肝细胞的氧化损伤和凋亡往往是肝纤维化发生的始动因素。葡萄糖调节蛋白75(简称Grp75)是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，在缺糖、辐射等应激条件下，Grp75呈上调表达，以起到保护蛋白质，协助蛋白质(特别是线粒体蛋白质)转运，提高细胞对应激反应耐受性的作用。Grp75在缺糖损伤时通过减少ROS和脂质过氧化物的产生，以及增加 ATP 水平保护细胞。(YanLIU，WenLIU, XiaodongSONG, JiZU0.Effectof Grp75 over expression on intracellular ATP level, mitochondrialmembranepotential and ROS accumulation following glucose deprivation in PC12cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry 2005, (268):45-51 ；Zuo J,Xia BI,Massa SM,etal.GRP75 is upregulated in ischemic brain.[J].J.Neurochem.1996,67:S33A.)同时GRP75能通过阻止Bax构象改变、延迟Cyt C释放抑，调控Raf/Mek/Erk途径等细胞凋亡通路，从而对缺糖等应激造成的细胞凋亡起到抑制作用。P53蛋白的C端312 352氨基酸残基处具有Grp75结合信号，Grp75与p53发生结合，可抑制p53移位到线粒体和核，继而分别抑制了 P53介导的线粒体凋亡途径和转录依赖性凋亡途径。所以Grp75可以通过多种作用机制抑制细胞凋亡，对细胞损伤起到保护作用。(Wadhwa R, Takano S, Kaur K, DeocarisCC, Pereira-Smith 0M, Reddel RR, Kaul SC.Upregulation of mortalin/mthsp70/Grp75contributes to human careinogenesis.1nt J Cancer.2006 Jun 15 ；118 (12):2973-80.)Grp75在心脏、脑、肺、脾等多种组织中有构成性表达，当细胞损伤发生时，伴侣分子Grp75可以应激性上调，起到细胞保护效应，抑制细胞凋亡进程。然而Grp75在肝组织中却没有构成性表达(李华，杨增杰，夏蓓莉，左伋.葡萄糖调节蛋白75的表达特性.[J].复旦学报(医学科学版)，2001,28 (5):382)，如何在肝细胞发生损伤时，我们将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上上使Grp75上调表达，进一步产生其抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用已引起有关领域研究者的关注。发明内容:本发明的目的是提供Grp75基因新的用途，具体涉及Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途。尤其涉及Grp75对肝细胞的过氧化氢造成的损伤保护作用和Grp75对由CCL4S导的肝纤维化的治疗作用。具体的，本发明采用7702细胞进行细胞实验，通过加入H202 (400umol/ml)的DMED培养基建立肝细胞氧化损伤模型，用MTT法检测正常组和Grp75上调组在给予氧化损伤的细胞存活率影响；用赖式法检测AST，ALT等血清学指标，用荧光探针标记ROS和线粒体跨膜电位用荧光显微镜观察其变化；采用以CCL4腹腔注射法制作大鼠肝纤维化模型，将Grp75基因转入动物，鉴定证实Grp75在肝脏中上调表达，以病理学、组织中线粒体功能(ATP生成、CytoC)和血清中AST, ALT的变化，观察Grp75对模型动物的治疗作用；实验结果表明，上调Grp75能通过线粒体保护作用，缓解细胞氧化损伤，抑制肝细胞凋亡，从而减缓肝纤维化发展的进程，达到对肝纤维化的治疗效果。更具体地本发明的目的通过下述技术方案实现:
1.建立细胞氧化损伤模型，其中包括:7702细胞常规培养；加入H2O2建立7702细胞氧化损伤模型；用MTT比色法鉴定7702细胞H2O2氧化损伤模型；2.Grp75基因转入7702细胞，其中包括:构建Grp75上调质粒；脂质体转染法将Grp75基因转入7702细胞；Western blot检测细胞内GRP75表达；3.Grp75转基因保护细胞氧化损伤，其中包括:细胞培养与分组；赖氏法检测细胞内AST，ALT水平；用荧光探针标法检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species, R0S)的生成；用突光探针标法检测线粒体膜电位(mitochondria membrane potential, MMP);用虫突光素酶法检测细胞内腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate, ATP)；4.动物肝纤维化模型建立，本发明的实施例中优选建立CCL4诱导大鼠肝纤维化模型；5.GRP75转基因治疗大鼠肝纤维化，其中包括:构建Grp75上调质粒；将质粒用转染试剂转入大鼠；免疫组化和Western blot观察GRP75转入大鼠后的表达量；6.Grp75转基因治疗作用观察，其中包括:动物肝组织病理切片观察；AST，ALT等血清学指标检测；ATP线粒体腺嘌呤核苷三憐酸(adenosine triphophate)检测；Western blot检测细胞色素C表达。本发明提供了 Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途；尤其是Grp75对肝细胞的过氧化氢造成的损伤保护作用和Grp75对由CCL4诱导的肝纤维化的治疗作用。本发明基于Grp75是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，其N端1_23位点为线粒体的穿膜信号，帮助蛋白正确折叠、协助蛋白质的转运，具有清除R0S、抗细胞凋亡的作用等特性，进行了 Grp75对H2O2诱导的细胞氧化应激的细胞保护作用试验，和CCL4诱导下的肝纤维化为病理基础的动物模型的保护作用试验，在肝细胞发生损伤时，将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上使其上调表达，结果显示，通过Grp75蛋白的抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用可达到治疗肝纤维化的效果。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
:图1是MTT法检测正常组细胞，损伤组细胞，Grp75高表达组细胞，Grp75高表达后损伤的细胞各组细胞的细胞活力。图2是正常组细胞，损伤组细胞，Grp75高表达组细胞，Grp75高表达后损伤的细胞线粒体膜电位的变化。图3是蛋白质免疫印迹检测细胞色素C在胞浆中的表达量。图4是蛋白质免疫印迹法检测动物转基因效果。图5是用免疫组织化学观察动物转基因后Grp75表达量。图6是HE染色观察四组动物在病理学上的差异。图7是蛋白质免疫印迹法检测肝脏细胞色素C的表达差异。图8是动物肝脏组织线粒体ATP检测结果。
具体实施方式
:实施例1细胞实验I细胞氧化损伤模型的建立和鉴定1.1细胞与主要试剂:7702 细胞购自中国科学院细胞，噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT),购自amresco公司，二甲基亚讽(DMSO),购自merck公司，高糖培养基(DMEM)购自invitrogen公司，H2O2购自上海生工。1.2实验步骤:取对数生长期的7702细胞，制成单细胞悬液，以5X IO4个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，每组6个复孔，正常组细胞与GRP75上调组细胞各两组，200 μ I培养液37°C、5% CO2培养箱中培养12小时后，加入400uM H2O2继续培养2小时，随后进行MTT检测，即弃去细胞培养上清，用培养基洗一次，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)溶液，放回培养箱内继续培养4小时，吸弃上清后，加150 μ I DMSO溶解沉淀，振荡10分钟后，酶标仪上检测492nm处测定OD值。MTT检测细胞活率结果显示:7702细胞在400uM H2O2损伤条件下，活率降低；与对照组相比，Grp75高表达组的细胞活力未有明显改变，而转染Grp75的细胞在H2O2损伤后细胞活率明显较损伤组升高(如图1所示)，2.Grp75 转染细胞2.1主要试剂:PCRMIX，凝胶回收试剂盒，质粒小抽试剂盒(天根公司),T4连接酶载体(TAKARA)2.2EGFP-N2/Grp75 表达质粒构建
左边引物，5‘TAAGGATCCATGATAAGCGCCAGCAGA，3 BamHl
右边引物’5 ‘GGCGGTACCTTACTGTTTCTCTTCCTTC’ 3 Kpnl带有BamHl KpnI的限制性内切位点的目的基因PCR扩增弓丨物2.3表达载体质粒扩增、提取与鉴定以实验室现有的C_myc/Grp75质粒为模板以BamHl，Kpnl为引物进行PCR扩增，反应体系为:Iul 模板IOum BamHl primerIOum Kpnl primer5ul IOX Taq buffer4ul d NTP mix0.5ul TaqddH20 补至 50ul所得产物通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯后保存，将EGFP-N2质粒用BamHl和Kpnl双酶切，纯化产物并回收，将PCR所得Grp75序列用DNA连接酶连入EGFP-N2，随后将重组后的质粒转化入感受态细胞中通过蓝白斑筛选后，挑取菌落进行测序。2.4Grp75的细胞转染与鉴定转染前24小时物在500ul无抗完全培养基中接种0.5-2X105个细胞用50ul的DMEM培养基稀释0.8ug质粒DNA静置5分钟，50ul稀释2ul LIP2000转染试剂，混合转染试剂和质粒DNA稀释液，静置20分钟将转染复合物加入到24孔板细胞中IOOul/孔，将孔板置于37°C, 5%二氧化碳培养箱中培养18小时,在转染6小时的时候换新鲜培养基。所得的细胞用0.2mg/mlG418筛选3 5天换筛选液9天后挑取单克隆进行培养。所得细胞提取蛋白进行Western blot鉴定。3.转入Grp75对细胞氧化损伤保护作用3.1线粒体活性氧检测3.1.1主要试剂:H2DCFDA(R0S检测试剂)购自invitrogen公司，高糖培养基(DMEM)购自invitrogen 公司。3.1.2.实验步骤:取对数生长期的7702细胞，以8X IO5个/ml的细胞密度接种于放有圆形玻片的24孔培养板，每组3个复孔，500 μ I培养液，37°C>5% CO2培养箱中培养12小时后，加入400uMH2O2继续培养2小时于检测细胞内ROS。即将24孔板内培养液弃去，用无血清DMEM洗细胞三次，加入500 μ I工作液浓度为IOmM的H2DCFDA, 37°C细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以488nm激发波长，525nm发射波长，于荧光酶标仪检测ROS值。荧光法检测活性氧结果显示:损伤组ROS的荧光强度，明显高于正常对照组；而Grp75高表达组经H2O2的作用后，荧光强度比正常组和对照组稍高，而明显要比损伤组低，这表示Grp75可以有效控制细胞内活性氧的生成。表I是ROS荧光强度检测结果。
表I
权利要求
1.Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝脏纤维化是肝细胞的过氧化氢造成的损伤。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝脏纤维化是由CCL4诱导的肝纤维化。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Grp75的上调改善肝细胞氧化损伤。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Grp75通过调节肝细胞线粒体功能抑制肝 细胞凋亡。
全文摘要
本发明属分子生物学领域，涉及应用基因转染技术Grp75在制备治疗肝细胞氧化损伤和肝脏纤维化药物中的用途。本发明基于Grp75是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，其N端1-23位点为线粒体的穿膜信号，帮助蛋白正确折叠、协助蛋白质的转运，具有清除ROS、抗细胞凋亡的作用等特性，进行了Grp75对H2O2诱导的细胞氧化应激的细胞保护作用试验，和CCL4诱导下的肝纤维化为病理基础的动物模型的保护作用试验，在肝细胞发生损伤时，将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上使其上调表达，结果显示，通过Grp75蛋白的抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用可达到治疗肝纤维化的效果。本发明的Grp75基因可制备治疗肝脏纤维化药物。
文档编号A61K48/00GK103203026SQ20121001141
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者刘雯, 左伋, 鄂裘恺, 刘平 申请人:复旦大学, 上海中医药大学