低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法及其应用；1)羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的合成：利用正硅酸乙酯为原料，制备出粒径为80～150纳米的二氧化硅纳米颗粒；2)低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备：羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面连接分子量大小为600的低分子量聚醚酰亚胺；制备方法最终制备的介孔二氧化硅基因纳米载体的直径为85～155纳米。3)细胞转染:二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并转染Hela细胞。本发明操作便捷，快速，反应条件温和；基因纳米载体的形貌均匀，细胞毒性低，具有较高的基因转染效率；在生物技术和医药技术领域具有较大的应用情景。
【专利说明】
低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种制备便捷，反应条件无毒无害，转染效率高的一种低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法及其应用，属生物技术和医药技术领域。
【背景技术】
[0002]基因转染是一种非常常规的生物和医药技术，但是通常的基因转染用的试剂是相对分子质量为25，000的聚醚酰亚胺(PEI)，虽然该PEI比相对分子质量为600的PEI的转染效率高，但是其细胞毒性也比相对分子质量为600的PEI大得多，因此将相对分子质量为600的PEI连接至一纳米微球上便可以成功制备出一种转染效率高，细胞毒性低的新型基因转染载体。
[0003]此外，用常规的基因转染试剂进行转染细胞时，很难方便的示踪基因载体的具体位置，也就无法判定目标细胞是否有外源基因的的进入。于是可以通过先合成一种含有介孔的基因纳米载体，然后装载有机染料(如可以对细胞质进行着色的红色罗丹明)来对细胞质进行着色，以达到示踪基因载体和对靶向细胞着色的目的，并评估目的基因是否进入了靶向细胞。因此，研制出一种具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因载体具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。
【发明内容】
[0004]根据现有技术的不足，我们提出具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因载体的制备方法。
[0005]本发明的技术方案包括:
[0006]I)羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的合成:利用正硅酸乙酯为原料，制备出粒径为80?150纳米的二氧化娃纳米颗粒；
[0007]2)低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备:羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面连接分子量大小为600的低分子量聚醚酰亚胺；制备方法最终制备的介孔二氧化硅基因纳米载体的直径为85?155纳米。
[0008]3)细胞转染:二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并转染Hela细胞。
[0009]具体技术方案如下:
[0010]1.羧基化介孔二氧化娃纳米颗粒的合成步骤如下:
[0011]I)在反应容器中配制浓度为I %?2%的十六烷基三甲基溴化铵的溶液10?20毫升；
[0012]2)加入5?10毫升的无水乙醇和100?200微升I摩尔/升的氢氧化钠，于400?500转/分钟，50?60°C加热条件下，搅拌反应10?30分钟；
[0013]3)向反应容器中加入200?300微升的正硅酸乙酯于400?500转/分钟，50?60°C加热条件下搅拌反应10?20分钟，然后关闭加热再于400?500转/分钟条件下，搅拌反应30?40分钟；
[0014]4)反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
[0015]5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10?20毫克，用无水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
[0016]6)向反应容器中加入0.5?0.6克氯化钠，于400?500转/分钟，50?60 °C加热条件下搅拌反应3?5小时；
[0017]7)反应结束后，静止20?30分钟，将上清转移至一离心管中，以12,000?13,000转/分钟，离心20?30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀I?3遍，得到介孔二氧化娃纳米颗粒；
[0018]8)取介孔二氧化硅纳米颗粒10?20毫克，用无水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
[0019]9)加入10?20毫克的3-溴丙酸，以50?60W的功率超声完全溶解3-溴丙酸；
[0020]10)于400?500转/分钟，15?20°C条件下搅拌反应6?8小时；
[0021]11)待反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，得到羧基化的介孔二氧化娃纳米颗粒。
[0022]2.低毒介孔二氧化硅基因纳米的载体制备步骤如下:
[0023]I)取羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒10?20毫克，用无水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
[0024]2)加入200?300微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400?500转/分钟，15?20 °C条件下搅拌反应6?8小时；
[0025]3)反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即得到低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体。
[0026]3.二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白质粒DNA并转染Hela细胞的方法如下:
[0027]I)取二氧化硅基因纳米载体10?20毫克，用无菌去离子水配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一无菌管中，冰箱保存备用；
[0028]2)取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50?100微升无血清培养基OPT1-MEM和0.3?0.5微克的绿色荧光蛋白质粒DNA并充分混匀；
[0029]3)加入步骤I)的二氧化硅基因纳米载体I?2微升，并混匀后静止20?30分钟，SP得到吸附有质粒DNA的基因纳米载体；
[0030]4)将吸附有质粒DNA的基因纳米载体50?100微升加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中；
[0031 ] 5)于37°C，5 % 二氧化碳培养箱中培养4?8小时后吸取培养液，加入200?300毫升的新鲜完全培养液；
[0032]6)于37°C，5% 二氧化碳培养箱中培养12?24小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率。
[0033]本发明的优势:制备过程不涉及任何有毒有害的试剂，操作便捷，快速，反应条件温和;无毒害。制备的基因纳米载体的形貌均匀，细胞毒性低，细胞存活率达到80%?95%。具有较高的基因转染效率;制备的基因纳米载体的基因转染效率为40?70%。在生物技术和医药技术领域具有较大的应用情景。
【附图说明】
[0034]图1:用溶胶凝胶法制备的介孔二氧化硅基因纳米载体的透射电子显微镜照片(形貌分析)。
[0035]图2:低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的细胞毒性分析。
[0036]图3:低毒介孔二氧化硅基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)基因至人宫颈癌细胞(Hela细胞)后的表达结果。
【具体实施方式】
[0037]下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0038]实施例1:
[0039]—种低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0040]I)利用溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米颗粒:取一反应容器，向其中配制浓度为1%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液1毫升。加入5毫升的无水乙醇和100微升I摩尔/升的氢氧化钠，于400转/分钟，50°C加热条件下，搅拌反应10分钟。向反应容器中量取200微升的正硅酸乙酯于400转/分钟，60°C加热条件下搅拌反应20分钟，然后关闭加热再于400转/分钟条件下，搅拌反应40分钟。待反应结束后，立即以13，000转/分钟，离心30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀I遍，产物真空干燥处理后保存。
[0041 ] 2) 二氧化硅纳米颗粒除去模板CTAB:取步骤I)中制得的二氧化硅纳米颗粒1毫克，用无水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。向该反应容器中称取0.5克氯化钠，于400转/分钟，50 0C加热条件下搅拌反应3小时。待反应结束后，静止30分钟，将上清转移至一离心管中，以13，000转/分钟，离心30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀I遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒，产物真空干燥处理后保存。
[0042 ] 3) 二氧化硅纳米颗粒的羧基化:取步骤2)所述的制备方法制备的二氧化硅纳米颗粒10毫克，用无水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。加入10毫克的3-溴丙酸，以50W的功率超声完全溶解3-溴丙酸。于400转/分钟，15°C条件下搅拌反应6小时。待反应结束后，以13，000转/分钟，离心30分钟，并用去离子水洗涤沉淀I遍。
[0043]4)羧基化二氧化娃纳米颗粒表面接PEI:取步骤3)所述的制备方法制备的羧基化的二氧化硅纳米颗粒10毫克，用无水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。加入200微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于400转/分钟，15°C条件下搅拌反应6小时。待反应结束后，以13，000转/分钟，离心30分钟，并用去离子水洗涤沉淀I遍，即得到可以吸附DNA的基因纳米载体，产物真空干燥处理后保存。
[0044]实施例2:
[0045]—种低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0046]I)利用溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米颗粒:取一反应容器，向其中配制浓度为1.5 %的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液15毫升。加入7毫升的无水乙醇和150微升I摩尔/升的氢氧化钠，于450转/分钟，550C加热条件下，搅拌反应20分钟。向反应容器中量取250微升的正硅酸乙酯于450转/分钟，55°C加热条件下搅拌反应15分钟，然后关闭加热再于450转/分钟条件下，搅拌反应35分钟。待反应结束后，立即以12，500转/分钟，离心25分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀2遍，产物真空干燥处理后保存。
[0047]2) 二氧化硅纳米颗粒除去模板CTAB:取步骤I)中制得的二氧化硅纳米颗粒15毫克，用无水乙醇配制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。向该反应容器中称取0.55克氯化钠，于450转/分钟，55 V加热条件下搅拌反应4小时。待反应结束后，静止25分钟，将上清转移至一离心管中，以12，500转/分钟，离心25分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀2遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒，产物真空干燥处理后保存。
[0048]3) 二氧化硅纳米颗粒的羧基化:取步骤2)所述的制备方法制备的二氧化硅纳米颗粒15毫克，用无水乙醇配制成15毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。加入15毫克的3-溴丙酸，以50?60W的功率超声完全溶解3-溴丙酸。于450转/分钟，18°C条件下搅拌反应6?8小时。待反应结束后，以12，500转/分钟，离心25分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍。
[0049]4)羧基化二氧化娃纳米颗粒表面接PEI:取步骤3)所述的制备方法制备的羧基化的二氧化硅纳米颗粒15毫克，用无水乙醇配制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。加入250微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于450转/分钟，18°C条件下搅拌反应7小时。待反应结束后，以12，500转/分钟，离心250分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，即得到可以吸附DNA的基因纳米载体，产物真空干燥处理后保存。
[0050]实施例3:
[0051 ] 一种低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0052]I)利用溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米颗粒:取一反应容器，向其中配制浓度为2%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液20毫升。加入10毫升的无水乙醇和200微升I摩尔/升的氢氧化钠，于500转/分钟，60 0C加热条件下，搅拌反应30分钟。向反应容器中量取300微升的正硅酸乙酯于500转/分钟，60°C加热条件下搅拌反应20分钟，然后关闭加热再于500转/分钟条件下，搅拌反应40分钟。待反应结束后，立即以12，000转/分钟，离心20分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀3遍，产物真空干燥处理后保存。
[0053]2) 二氧化硅纳米颗粒除去模板CTAB:取步骤I)中制得的二氧化硅纳米颗粒20毫克，用无水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。向该反应容器中称取
0.6克氯化钠，于500转/分钟，60 0C加热条件下搅拌反应5小时。待反应结束后，静止20分钟，将上清转移至一离心管中，以12，000转/分钟，离心20分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒，产物真空干燥处理后保存。
[0054]3) 二氧化硅纳米颗粒的羧基化:取步骤2)所述的制备方法制备的二氧化硅纳米颗粒20毫克，用无水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。加入20毫克的3-溴丙酸，以60W的功率超声完全溶解3-溴丙酸。于4500转/分钟，20°C条件下搅拌反应8小时。待反应结束后，以12，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍。
[0055]4)羧基化二氧化娃纳米颗粒表面接PEI:取步骤3)所述的制备方法制备的羧基化的二氧化硅纳米颗粒20毫克，用无水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中。加入300微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于500转/分钟，20°C条件下搅拌反应8小时。待反应结束后，以12，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，即得到可以吸附DNA的基因纳米载体，产物真空干燥处理后保存。
[0056]实施例4:
[0057]二氧化硅基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)DNA至动物细胞，具体步骤如下:
[0058]I)二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA:取上述步骤的制备方法制备的二氧化硅基因纳米载体10毫克，用无菌去离子水配制成5毫克/毫升的溶液并转移至一无菌管中，冰箱保存备用。另取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50微升无血清培养基OPT1-MEM和0.3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀。加入I微升二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止20分钟，即得到吸附有质粒DNA的基因纳米载体。
[0059]2)吸附有绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的二氧化硅纳米载体转染基因至动物细胞:将步骤I)所述的制备方法制备的含有外源基因质粒DAN和二氧化硅纳米载体的复合物50微升加入至一48孔板的海拉(Hela)细胞中。于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养4小时后吸取培养液，加入200毫升的新鲜完全培养液。于37 °C，5 % 二氧化碳培养箱中培养12小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率，基因表达效率如图3所示。
[0060]实施例5:
[0061 ] 二氧化硅基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)DNA至动物细胞，具体步骤如下:
[0062]I)二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA:取上述步骤的制备方法制备的二氧化硅基因纳米载体15毫克，用无菌去离子水配制成10毫克/毫升的溶液并转移至一无菌管中，冰箱保存备用。另取一无菌的1.5毫升的离心管，加入75微升无血清培养基OPT1-MEM和0.4微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀。加入1.5微升二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止25分钟，即得到吸附有质粒DNA的基因纳米载体。
[0063]2)吸附有绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的二氧化硅纳米载体转染基因至动物细胞:将步骤I)所述的制备方法制备的含有外源基因质粒DAN和二氧化硅纳米载体的复合物75微升加入至一48孔板的海拉(Hela)细胞中。于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养6小时后吸取培养液，加入250毫升的新鲜完全培养液。于37 °C，5 % 二氧化碳培养箱中培养18小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率，基因表达效率如图3所示。
[0064]实施例6:
[0065]二氧化硅基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)DNA至动物细胞，具体步骤如下:
[0066]I)二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA:取上述步骤的制备方法制备的二氧化硅基因纳米载体20毫克，用无菌去离子水配制成20毫克/毫升的溶液并转移至一无菌管中，冰箱保存备用。另取一无菌的1.5毫升的离心管，加入100微升无血清培养基OPT1-MEM和0.5微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀。加入2微升二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止30分钟，即得到吸附有质粒DNA的基因纳米载体。
[0067]2)吸附有绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的二氧化硅纳米载体转染基因至动物细胞:将步骤I)所述的制备方法制备的含有外源基因质粒DAN和二氧化硅纳米载体的复合物100微升加入至一24孔板的海拉(Hela)细胞中。于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养8小时后吸取培养液，加入300毫升的新鲜完全培养液。于37 °C，5 % 二氧化碳培养箱中培养24小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率，基因表达效率如图3所示。
[0068]实施例7:
[0069]形态观察、粒径及其分布测定。取介孔二氧化硅基因纳米载体溶液经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到介孔二氧化硅基因纳米载体呈均匀规则的球形粒子，其直径在80?150nm范围内可控。所制得的纳米载体如图1所示。
[0070]实施例8:
[0071]介孔二氧化硅基因纳米载体的细胞生物安全性测定。用DMEM培养基配制0.05?I毫克每毫升的不同浓度介孔二氧化硅基因纳米载体溶液，并与Hela细胞于37°C，5% 二氧化碳培养箱中孵育24小时。然后用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞存活效率。MTT检测结果显示:当介孔二氧化硅基因纳米载体浓度达到I毫克每毫升时，其细胞存活仍率在78 %以上。MTT检测介孔二氧化硅基因纳米载体的细胞存活率结果如图2所示。
[0072]本发明公开和提出的一种低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法及其应用，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1.一种低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法;其特征是包括如下步骤: 1)羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的合成:利用正硅酸乙酯为原料，制备出粒径为80?150纳米的二氧化娃纳米颗粒； 2)低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体的制备:羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面连接分子量大小为600的低分子量聚醚酰亚胺；制备方法最终制备的介孔二氧化硅基因纳米载体的直径为85?155纳米。2.如权利要求1所述的方法，其特征是羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的合成步骤如下: 1)在反应容器中配制浓度为I%?2%的十六烷基三甲基溴化铵的溶液10?20毫升； 2)加入5?10毫升的无水乙醇和100?200微升I摩尔/升的氢氧化钠，于400?500转/分钟，50?60°C加热条件下，搅拌反应10?30分钟； 3)向反应容器中加入200?300微升的正硅酸乙酯于400?500转/分钟，50?60°C加热条件下搅拌反应10?20分钟，然后关闭加热再于400?500转/分钟条件下，搅拌反应30?40分钟； 4)反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒； 5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10?20毫克，用无水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中； 6)向反应容器中加入0.5?0.6克氯化钠，于400?500转/分钟，50?60°C加热条件下搅拌反应3?5小时； 7)反应结束后，静止20?30分钟，将上清转移至一离心管中，以12，000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀I?3遍，得到介孔二氧化娃纳米颗粒； 8)取介孔二氧化硅纳米颗粒10?20毫克，用无水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中； 9)加入10?20毫克的3-溴丙酸，以50?60W的功率超声完全溶解3-溴丙酸； 10)于400?500转/分钟，15?20°C条件下搅拌反应6?8小时； 11)待反应结束后，以12,000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，得到羧基化的介孔二氧化娃纳米颗粒。3.如权利要求1所述的方法，其特征是低毒的基因纳米载体制备步骤如下: 1)取羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒10?20毫克，用无水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中； 2)加入200?300微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400?500转/分钟，15?20°C条件下搅拌反应6?8小时； 3)反应结束后，以12，000?13，000转/分钟，离心20?30分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即得到低毒的介孔二氧化硅基因纳米载体。4.低毒的二氧化硅基因纳米载体应用于吸附DNA及细胞转染。5.如权利要求4所述的应用，其特征是二氧化硅基因纳米载体吸附绿色荧光蛋白质粒DNA并转染Hela细胞的方法如下: I)取二氧化硅基因纳米载体10?20毫克，用无菌去离子水配制成5?20毫克/毫升的溶液并转移至一无菌管中，冰箱保存备用； 2)取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50?100微升无血清培养基OPT1-MEM和0.3?0.5微克的绿色荧光蛋白质粒DNA并充分混匀； 3)加入步骤I)的二氧化硅基因纳米载体I?2微升，并混匀后静止20?30分钟，即得到吸附有质粒DNA的基因纳米载体； 4)将吸附有质粒DNA的基因纳米载体50?100微升加入至一24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中; 5)于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养4?8小时后吸取培养液，加入200?300毫升的新鲜完全培养液； 6)于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养12?24小时后，用荧光显微镜观察并计算基因表达效率。
【文档编号】C12N15/87GK105861560SQ201610209588
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】常津, 郑斌, 王汉杰, 谌红彬, 潘慧卓, 常天赐
【申请人】天津大学