一种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，该方法利用载体质粒pSFV2作为携带外源基因的载体，与包装质粒pHelper转染真核细胞后，使得外源基因表达的目的蛋白具有生物活性，且采用该方法表达纯化出的目的蛋白纯度高，特异性强且具有较强的生理活性以及药物活性。
【专利说明】
-种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法
技术领域
[0001 ]本发明设及生物工程领域，具体而言，设及生物活性蛋白在真核细胞中的重组表 达方法。
【背景技术】
[0002] 目前，具有生物活性的蛋白对真核细胞，尤其是在生物医药方面W及在人类生命 系统中都具有重要的生理意义。由于，现有原核细胞表达系统不具备蛋白质合成后翻译和 修饰的能力，且低等真核生物的蛋白翻译和修饰系统与高等真核生物的蛋白翻译和修饰系 统具有很大的差异，因此，原核生物，如细菌，病毒等无法表达出经修饰后的蛋白质如膜蛋 白等具有生物活性的蛋白。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，该方法 能够有效地表达出具有生物活性的蛋白。
[0004] 本发明解决其技术问题是采用W下技术方案来实现的。
[0005] -种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其包括：
[0006] 将外源基因连接至载体质粒，再将载体质粒和包装质粒转染包装细胞，培养转染 后的包装细胞，得到病毒载体，载体质粒为PSFV2，包装质粒为P化Iper;
[0007] 将病毒载体转染到宿主细胞中，经培养后，收集上清液，宿主细胞为真核细胞；W 及
[000引离屯、、纯化上清液，得到外源基因表达的具有生物活性的目的蛋白。
[0009] 本发明提供的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法的有益效果是:通过采 用携带外源基因的PSFV2载体质粒和P化Iper包装质粒共转染包装细胞，进行包装后，得到 携带外源基因的病毒载体，再将得到病毒载体转染真核宿主细胞进行重组表达，通过该方 法，使得外源基因在真核宿主细胞表达出的目的蛋白经过了真核生物的蛋白翻译和修饰系 统而具有生物活性，且表达出的蛋白的特异性高。
【附图说明】
[0010] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，W下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运 些附图获得其他相关的附图。
[001 U 图巧本发明实施例1的载体质粒PSFV2的图谱；
[001 ^ 图2为本发明实施例1的包装质粒抑e Iper的图谱；
[0013]图3为本发明实施例1得到的未带有放射性同位素标记的GP120-1和GP120-2的蛋 白凝胶电泳图；
[0014] 图4为本发明实施例1得到的带有放射性同位素35S标记的GP120-1和GP120-2的蛋 白凝胶电泳图；
[0015] 图5为本发明实施例1得到的GP120-1和GP120-2抑制CD4抗体与CD4分子结合的能 力；
[0016] 图6为本发明实施例1得到的带有放射性同位素35S标记的GP120-1和GP120-2与膜 蛋白CCR5结合能力；
[0017]图7为本发明实施例2的CD4蛋白的蛋白凝胶电泳图；
[0018] 图8为本发明实施例2得到的不同浓度CD4蛋白抑制X4-亚型艾滋病病毒入侵PBMC 的能力。
【具体实施方式】
[0019] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产 品。
[0020] 下面对本发明实施例的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法进行具体说 明。
[0021] -种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其包括如下步骤。
[0022] 步骤SI:制备病毒载体
[0023] 将外源基因连接至载体质粒，再将载体质粒和包装质粒转染包装细胞，培养转染 后的包装细胞，得到病毒载体。
[0024] 其中，较佳地，用于包装的包装细胞与后续步骤中的宿主细胞为同一类细胞。
[0025] 其中，载体质粒为PSFV2，其结构如图1所示;包装质粒为抑elper，其结构如图2所 /J、- O
[0026] 具体地，用限制性内切酶对载体质粒和包装质粒进行酶切处理，形成线性DNA，再 将线性DNA经转录得到RNA，将RNA转染包装细胞，经培养后，得到携带外源基因的病毒载体。
[0027] 其中，较佳地，限制性内切酶为SpeK
[0028] 现有的蛋白纯化方法由于因为缺乏特异性标记，导致在蛋白纯化的过程中无法达 到生物医学和药物水平的功能性纯度或者生理活性，因此，为了提高外源基因表达出的目 的蛋白在后续纯化过程中的纯度。需要在目的蛋白的C端融合有特异性标签多肤。
[0029] 目的蛋白的C端融合一个特异性标签多肤(命名为Str邱-tag I)，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示），具有上述氨基酸序列的特异性标签多肤与后续纯化步骤中的离子交换 树脂的亲和性较高，能够特异性地结合在离子交换树脂上，进而有利于纯化目的蛋白。
[0030] 进一步地，还可W在目的蛋白的C端融合两个特异性标签多肤(命名为strep-tag IDeStr邱-化g II与后续纯化步骤中的离子交换树脂的亲和性更高，更有利于得到高纯度 的目的蛋白。
[0031] 因此，相应地，在本步骤中，在外源基因的终止子后紧邻径基末端再连接特异性标 签。该特异性标签(命名为tag I或tag II)用于编码上述特异性标签多肤(strep-tag I或 Strep-tag II)，1:ag I编码Str邱-1:ag I，1:ag II编码Strep-1:ag II，其中，tag II的核巧酸 序列如SEQ ID NO.2所示，能够编码Str邱-tag II，其中，第25位~第48位为编码第一个特 异性标签多肤的核巧酸序列，第85位~第108为编码第二个特异性标签多肤的核巧酸序列。
[0032] 需要说明的是，目的蛋白的C端融合的特异性标签多肤的数量可W根据目的蛋白 的分子量进行增加，目的蛋白的分子量越大，其融合的特异性标签多肤的数量越多例如两 个或=个等，得到的融合蛋白与后续步骤中的离子交换树脂的亲和性就越高，就更利于纯 化目的蛋白。
[0033] 步骤S2:转染宿主细胞
[0034] 将上述病毒载体转染到宿主细胞中，宿主细胞经培养后，外源基因表达的目的蛋 白分泌到宿主细胞外的培养液中，收集上清液即可。当然，在转染前，需要对病毒载体进行 失活处理。
[0035] 其中，较佳地，宿主细胞为真核细胞。
[0036] 其中，更佳地，真核细胞为哺乳动物细胞。
[0037] 具体地，哺乳动物细胞为幼仓鼠肾细胞(B皿-21)，且B皿-21细胞具有无限增殖的 能力。
[003引采用B皿-21细胞作为外源基因表达的宿主细胞能够克服现有的原核生物表达系 统不具备蛋白质合成后翻译和修饰的缺点，且外源基因在B皿-21细胞中能够表达出高纯 度、高特异性的目的蛋白，去满足不断提高的生物医学研究和药物研发需求。
[0039] 步骤S3:离屯、、纯化上清液
[0040] 对得到的上清液进行离屯、、纯化处理，得到目的蛋白，目的蛋白具有生物活性。
[0041] 具体地，较佳地，利用具有与特异性标签多肤高亲和性的离子交换树脂对目的蛋 白进行纯化，获得的目的蛋白的纯度高，其能够用作各类生物、医学、药学临床和基础研究 (如药物筛选、中和性抗体筛选、分子标记定位、蛋白标准品制备等）。
[0042] 步骤S4:蛋白的定量检测
[0043] 现有的蛋白定量检测的方法(如BCA法，双尿酸滴定法等）需要对待检测的蛋白变 性才能定量检测。而且采用现有的蛋白定量检测方法的总蛋白的含量无法直接反应蛋白的 纯度，也无法确认蛋白的正确表达、表达状态W及多聚体的形成，无法对纯化产品实现最客 观的数量和质量控制。
[0044] 为解决上述缺点，在本发明中，将得到的目的蛋白进行垂直非变性凝胶电泳和考 马斯亮蓝染色标记方式来定量所获得的目的蛋白。
[0045] 具体地，将电泳后的凝胶置于考马斯亮蓝染色液中浸泡14~16小时，进行显色。
[0046] 具体地，将蛋白Marker、已知浓度的BSA蛋白（具有不同浓度的系列，起到标准曲线 的作用）、W及待定量的目的蛋白在同一凝胶上进行垂直非变性凝胶电泳。电泳完成后，将 凝胶浸泡在考马斯亮蓝染色液中14~16小时，进行显色。然后，根据目的蛋白在凝胶上的条 带的颜色深浅强度和已知浓度的BSA蛋白条带的颜色深浅强度对比，通过成像仪分析，便可 得到目的蛋白的浓度，实现蛋白的非变性定量检测。
[0047] W下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[004引实施例1
[0049]本实施例W分别表达纯化目的蛋白例如艾滋病病毒R5亚型的两个不同病毒株 (R5-1病毒株和R5-2病毒株)的膜蛋白（GP120-1和GP120-2)为例来说明本发明的特征和性 能。
[0化0] 1.表达纯化GPl 20-1
[0051] 第一步，制备携带外源基因即GP120-1基因的病毒载体，GP120-1基因的核巧酸序 列如沈Q ID ^.3所示，6口120-1基因可编码6口120-1蛋白。
[0052] 需要说明的是，为了提高在后续的纯化步骤中，确保GP120-1蛋白的纯化度较高， 在本实施例中，在GP120-1蛋白的C端融合两个特异性标签多肤（S化ep-tag II)该Strep-tag II能够与后续纯化步骤中的离子交换树脂具有高亲和性W及高特异性结合的特性，利 用该特性可将目的蛋白GP120-1蛋白进行高纯度的纯化。因此，在GP120-1基因的终止子后 需要连接特异性标签（tag,其核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示，该特异性标签编码Strep-化g II)，得到DNA片段GP120-1-tag IKGP120-1-tag II片段的核巧酸序列如SEQ ID N0.4 所示，其中第1~1512位为GP120-1基因的核巧酸序列，第1513~1620位为特异性标签的核 巧酸序列。
[0053] 首先，构建重组载体质粒pSFV2-GP120-1-tag II。
[0054] 往含有纯化的载体质粒pSFV2的管中，加入限制性内切酶BssHII和XmaI，置于37°C 酶切4小时，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到大片段(PSFV2经双酶切后带有黏 性末端的线性片段)。
[0055] 制备带有BssHII和XmaI酶切位点的GP120-1-tag II片段。根据GP120-1基因的序 列，设计分别带有BssHII酶切位点的正向引物，W及带有tag序列和XmaI酶切位点的反向引 物。WGP120-1基因序列为模板进行PCR扩增得到GP120-1基因的终止子后连接有tag的DNA 片段，即GP120-1-tag II片段，再用BssHII和XmaI双酶切对PCR扩增产物GP120-1-化g II片 段双酶切。酶切后的产物用1%琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收小片段(经双酶切带有黏性 末端的GP120-1-tag II片段）。当然，含有酶切位点的GP120-1-化g II片段也可通过基因合 成的方法直接合成，然后经双酶切后连接到PSFV2上。
[0056]大片段和小片段按1:5比例用T4DNA连接酶连接;将连接产物转化大肠杆菌E. COli 感受态例如Life Technologies公司的TOPlO,Agilent公司的化-10,再经过氨节霉素抗性 筛选(氨节霉素购自Interchim),挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BssHII和 XmaI双酶切鉴定，通过DNA测序确定得到重组载体质粒pSFV2-GP120-1-tag II。
[0化7] 其次，重组载体质粒pSFV2-GP120-1-tag II和包装质粒P化Iper共转染包装细胞。
[005引往含有pSFV2-GP120-1-tag II和抑elper的管中，加入限制性内切酶SpeI进行单 酶切，环形的pSFV2-GP120-1-tag H和抑elper被SpeI单酶切形成线性DNA，按照mMESSAGE mMAGfflNE?SP6Transcription Kit转录试剂盒的操作说明书操作，W该得到的线性 DNA为模板，进行转录。其中，反应体系中的各成分体积比如下，线性DNA模板:转录酶:反应 缓冲液(Reaction Buffer) = IOOmM dNTP为3:1:5:1，得到线性的RNA。
[0059] 接着，包装病毒颗粒，得到病毒载体。
[0060] 将包装细胞即BHK-21细胞(BHK-21细胞具有"不死性"，也就是具有无限增殖能力） 接种在GMM培养基中，置于37 °C、5 %C〇2条件下增殖培养，该GMM培养基，每SOOmL含有2 % 的IM 肥阳S缓冲液、1%的购自Life Technologies的IOOX penicillin/str邱 1:〇1117。;[]1^及 2.5 %的小牛血清。培养结束后，经消化、离屯、后，获得BHK-21细胞悬浮液，再用PBS缓冲液稀 释，得到每800化含有10*10 6个BHK-21细胞的悬浮液。往该悬浮液中加入RNA，按Gene Pulser Xcell? Electroporation Systems仪器(Biorad的电转仪）的操作说明书进行电转 染操作，把体外转录RNA转入到BHK-21细胞中，设定参数电压830V、电阻25化、电流4mA。
[0061] 将电转染后的悬浮液接种至新鲜的GMEM培养基中进行病毒颗粒的包装，置于37 °C、5 %C〇2条件下共培养30h。共培养结束后，将共培养液转入SW32Ti离屯、管（购自Beckman Coulter公司），于280(K)rpm、4°C条件下离屯、2小时，弃上清，保留沉淀，该沉淀即为包装后的 病毒颗粒，往管中加入4°C冰浴后的Tris-化Cl-抓TA溶液重悬沉淀，得到病毒悬浮液，然后 于4°C条件下静置2小时，再次重悬，该病毒悬浮液按每100毫升分装，于-80°C保存。
[0062] 第二步，病毒载体转染宿主细胞
[0063] 将宿主细胞即B皿-21细胞接种在GMEM培养基中，置于37 °C、5 % C〇2条件下增殖培 养直至细胞汇合度为80 %左右，然后去掉上清。该GMEM培养基，每500血含有IOmL IM肥阳S 缓冲液、1 %的IOOX penicillin/streptomycinW及2.5%的小牛血清。
[0064] 取出-80°C保存的病毒悬浮液，加入膜凝乳蛋白酶（Chymotrypsin，购自 Bohenringer Mammhem)和按体积比2:1的比例加入50mM无菌化C12溶液，常溫下激活病毒30 分钟。接着加入抑肤酶(aprotinin，购自Sigma公司），根据其标签上的Ki抑制值对病毒进行 失活处理。
[0065] 往去掉上清的增殖培养后的宿主细胞中加入SmL GMEM培养基(含经失活处理后的 病毒W及体积比为2%的小牛血清），置于37°C，培养1小时;然后再加入等量的GMEM培养基 (含2%的小牛血清），置于37°C，培养1小时；然后去掉上清。用GMEM培养基（不含小牛血清） 清洗细胞两次;然后再加入30mL不含小牛血清的GMEM培养基，置于37°C，培养28-30小时。外 源基因片段(GP120-1-tag II)随着宿主细胞的增殖，稳定地表达融合蛋白即GP120-1蛋白-S化ep-tag II，并分泌到上清液中，得到蛋白上清液。需要说明的是，该特异性标签多肤即 Str巧-tag II并不影响GPl20-1蛋白的生物活性。
[0066] 第=步，收集蛋白上清液并纯化目的蛋白
[0067] 培养结束后，收集蛋白上清液。将蛋白上清液转入50mL的1001d)a CUt-Off离屯、管 (小于100W)a的蛋白将被滤出，本实施例的融合蛋白即GPl20-1蛋白-Strep-tag II的分子 量大于l〇〇W)a，能够被截留在离屯、管中，购自Satorious公司），于4500巧m、4°C条件下离屯、 45分钟，重复离屯、4次，直至蛋白上清液剩下0.5mL。其中，前3次离屯、过程中，每次离屯、结束 后，清洗去掉离屯、管下方收集管的滤液，然后用4°C保存冷冻的PBS缓冲液进行等量补充，即 加入PBS缓冲液与离屯、管中剩余的蛋白上清液等体积混合，且该PBS缓冲液中含有体积比为 1:100的Img/ml的亲和素蛋白（Avidin)和1:10的IM NaCl。
[0068] 需要说明的是，因为生物素会非特异结合后续步骤中的离子交换树脂，严重降低 融合GP120-1蛋白的纯化过程，亲和素蛋白可用于结合并抑制细胞分泌出的生物素，有助于 提高GP120-1蛋白的纯化。
[0069] 离屯、后，剩余的0.SmL蛋白上清液用Gravity flowSlrep-Tactin" SuperfiowA column离子交换树脂柱(购自IBA公司)进行过柱纯化，过柱方法按其说明书进行。在滤过蛋 白上清液后，用2ml清洗缓冲液(washing buffer，购自IBA公司）清洗离子交换树脂柱，重复 5次；清洗结束后，使用5~IOml的IOX洗脱液（elution solution,含0.5%洋地黄皂巧 (Digitonin),购自IBA公司)将目的蛋白从离子交换树脂柱上滤出，得到蛋白滤出液。
[0070] 需要说明的是，该过柱纯化操作利用了离子交换树脂柱（Gravity flow S化p-Tactin I' Superflow?column)与特异性标签多肤的高亲和性W及高特异性结合的 特点，有效地过滤除去了蛋白上清液中的其他杂质蛋白，确保得到的蛋白滤出液含有的 GP120-1蛋白的纯度非常高，其纯度接近100%。
[0071] 将得到的蛋白滤出液转入50血的IOkDa州t-off离屯、管，于4500rpm、4°C条件下离 屯、10分钟，重复离屯、4次，直至蛋白滤出液剩下0.2~0.3mL。其中，在前3次离屯、过程中，每次 离屯、结束后，清洗去掉离屯、管下方收集管的滤液，然后用4°C保存冷冻的PBS缓冲液进行等 量补充，即加入PBS缓冲液与离屯、管中剩余的蛋白滤出液等体积混合。离屯、结束后，得到浓 缩蛋白滤出液。可于-80°C封装保存。该浓缩蛋白滤出液含有的GP120-1蛋白纯度非常高，且 具有生物活性。
[0072 ]第四步，蛋白定量检测分析
[0073] 首先，采用18孔蛋白电泳凝胶(化iteron !Swell)进行蛋白凝胶电泳。上样蛋白分 别为：待定量检测的含目的蛋白的浓缩蛋白滤出液、蛋白标记对照（PageRuler，购自 Thermofisher、分子量为25~200kDa)、W及用于制作标准曲线参照的BSA蛋白（购自 Thermof ischer公司，BSA原液浓度2mg/mL，上样时稀释成0.5-lOjig/iiL的标准范围）；电泳参 数:150V、1小时。
[0074] 电泳结束后，凝胶先用ddH2〇清洗一次，然后将凝胶置于考马斯亮蓝染色液 (protein stain buffer,购自thermofischer)中进行显色，于4°C浸泡过夜，隔天待目的条 带出现后，反复使用dd此0摇晃清洗(30min/次，5-6次左右），直至BSA蛋白参照条带和目的 蛋白条带没有其他杂质出现为止。然后利用FUJI成像仪或者其他成像设备对其成像，使用 即JI成像仪提供的分析软件IMAGE GAUGE (FUJI)或者IMAGEJ(NIH)软件对每个BSA蛋白参照 条带颜色深浅强度和其BSA蛋白浓度的对应关系进行分析(共6个BSA蛋白参照条带，其对应 的BSA浓度值分别是4蛇/化、2雌/化、化g/iiL、0.5雌/化、0.25蛇/化、0.12扣g/化），WBSA浓 度为横坐标、参照条带颜色深浅强度为纵坐标制得标准曲线，结合该标准曲线，通过得到目 的蛋白条带的颜色深浅强度计算出目的蛋白的浓度，实现蛋白的非变性定量检测目的。
[0075] 2.表达纯化 GPl 20-2
[0076] 表达纯化GP120-2的原理和步骤同表达纯化GP120-1。不同之处在于，在制备病毒 载体步骤中，用GP120-2基因替换GP120-1基因即可，在GP120-2基因的径基末端也连接tag 11^得到氨基末端融合有两个特异性标签多肤的6?120-2,6?120-2基因编码6?120-2。 GP120-2基因的核巧酸序列如沈Q ID N0.5。
[0077] 按上述方法的得到的GP120-1蛋白纯度非常高，且具有生物活性。
[007引 3. GPl 20-1和GPl 20-巧戶变性定量检测
[0079] W表达纯化出得到的含有GPl 20-1的蛋白滤出液和含有GPl 20-2的蛋白滤出液一 起进行蛋白凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色液中进行显色，与不同浓度的BSA蛋白参照条带 对比，对GPl 20-1和GPl 20-2进行定量检测。蛋白凝胶电泳结果如图3所示。
[0080] 由图3可知（图中M为Marker蛋白，1、2、3、4、5、6分别代表浓度为化g/化、2蛇/化、化 邑/化、0.5iig/化、0.25ygAiL、0.12扣g/化的BSA，7为GP120-1、8为GP120-2) ,GP120-1 和 〇口120-2蛋白分子量均在1204〇曰左右，6?120-1和6?120-2的浓度均为0.254旨/化左右。 GP120-1和GP120-2条带的位置不一致的原因在于糖基修饰导致目的蛋白的大小有差异。
[0081] 4.表达纯化带有放射性同位素标记的GP120-1或GP120-2。
[0082] 另外，还需要说明的是，本实施例提供的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达 方法除了可W对普通蛋白的进行表达纯化、还可W对带有放射性同位素 35S标记的蛋白进行 表达纯化，其具体的操作步骤与表达纯化未带有放射性同位素标记的蛋白的操作步骤基本 一致。不同之处在于:在病毒颗粒转染宿主细胞的步骤中，需要加入表达 35S标记的蛋白标签 试剂化as}fTag? E邱ress Protein Labeling Mix,购自化rkinelmer，含有[3日5化-甲硫氨 酸和[35S]k脫氨酸），具体如下。
[0083] 往去掉上清的增殖培养后的宿主细胞中加入SmL GMEM培养基(含经失活处理后的 病毒和2%的小牛血清），置于37°C，培养1小时;然后再加入等量的GMBl培养基(含2%的小 牛血清），置于37°C，培养3小时。
[0084] 然后去掉上清，用DMM培养基(不含有甲硫氨酸、脫氨酸W及小牛血清;但加入有 葡萄糖、1%的1〇〇乂9611；[(3；[11;[]1/3化691:〇1117(3；[]1^及1%的100乂左旋谷氨酷胺)清洗细胞两 次；
[0085] 然后再加入30mL的DMEM培养基(不含有未带放射性同位素标记的甲硫氨酸、脫氨 酸W及小牛血清，但加入有蛋白标签试剂，即加入有[ 35S化-甲硫氨酸和[35S化-脫氨酸、葡 萄糖、1%的IOOX penicillin/str邱tomycin、l%的IOOX左旋谷氨酷胺），并置于37°C，培养 28-30小时。
[0086] 夕F源基因片段(GP120-1-tag II)随着宿主细胞的增殖，稳定地表达带有35S标记的 融合蛋白即GP120-1-Strep-tag II蛋白或GP120-2-Strep-tag II蛋白，并分泌到上清液 中，可得到蛋白上清液。需要说明的是，该特异性标签多肤即Str邱-tag II并不影响GP120-1和GP120-2蛋白的生物活性。
[0087] 带有放射性同位素35S标记的GP120-1和GP120-2的蛋白凝胶电泳结果如图4所示。
[0088] 由图4可知（图中M为Marker蛋白，1、2、3、4、5、6分别代表浓度为化g/化、2蛇/化、化 邑/化、0.5iig/化、0.25ygAiL、0.12扣g/化的BSA，7为GP120-1、8为GP120-2) ,GP120-1 和 GP120-2均能被放射性同位素 35S标记。
[0089] 5.GP120-1和GP120-2的生物活性实验
[0090] (1)GP120-1或GP120-2对CD4抗体与HEK-CD4细胞膜上的CD4分子结合能力的影响
[0091] W能够稳定在细胞膜表面表达CD4分子的肥K-CD4细胞系作为结合受体，W能够与 CD4分子进行特异结合的且带有巧光标记的Q4120作为CD4抗体，WGP120-1和GP120-2作为 竞争性抑制剂，利用流式细胞仪的巧光筛选功能，在10化1实验反应体系中检测GP120-1或 GP120-2对CD4抗体与CD4分子的结合能力，该10化1反应体系含的50000个皿K-CD4细 胞、50iU的0.5nM的CD4抗体（clone Q4120,购自SIGMA)、25iU含有递增浓度的GP120-1或 GP120-2的蛋白溶液，在常溫20°C混合反应90分钟，离屯、去掉上清，加入化g/ml购自Life Techno Iogies的goat-anti-mouse的带有Al exa-647的偶联第二巧光抗体（416又日-647 secondary anti body)在冰上解育1小时（避光），然后清洗两次细胞，并加入1 %的 paraformaldehyde(多聚甲醒、购自Electron Microscopy)并通过BD bioscience的 CANTOII流式细胞仪进行检测。检测结果如图5所示。
[0092] 由图5可知蛋白浓度的对数作为横坐标、Q4120与CD4分子的结合力（％)作为纵 坐标，CD4抗体与CD4分子的结合力越小，表明GP120蛋白对CD4抗体的竞争抑制作用越强， GP120蛋白生理活性越高;a代表本实施例中WB皿-21细胞系表达纯化出的GP120-2，b代表 本实施例中WBHK-21细胞系表达纯化出的6口120-1，(3代表^5。2细胞系表达纯化出的 GP120-l，d代表WSF2细胞系表达纯化出的GP120-2;a和b为实验组，C和d为对照组），随着蛋 白浓度的增加，特异性CD4抗体与肥K-CD4细胞膜表面表达的CD4分子的结合能力下降，也说 明两组的GP120-1和GP120-2均能够竞争性抑制并识别CD4抗体的识别位点，降低CD4抗体的 与细胞表面CD4分子的结合力。
[0093] 另外，随着蛋白浓度的增加，实验组的GP120-1和GP120-2竞争性抑制CD4抗体与 CD4分子结合的能力高于对照组的GP120-2和GP120-1，由此表明，对照组WSF2细胞系表达 纯化得到的GP120-2和GP120-1分子的识别结合能力低于实验组WB皿-21细胞系作为宿主 细胞表达纯化得到的GP120-2和GP120-U低50~200倍），也进一步表明，通过本实施例的表 达纯化方法得到的蛋白具有较强的生理活性。
[0094] (2)放射性同位素35S标记的GP120-1或放射性同位素35S标记的GP120-2与皿K-CCR5细胞膜上的CCR5分子结合的饱和曲线
[00M] 首先裂解皿K-CCR5细胞系，获得皿K-CCR5细胞膜蛋白，肥K-CCR5细胞系在细胞膜 表面稳定表达CCR5分子，在化pendorf离屯、管上加入含有从0到40nM梯度浓度的、带有放射 性同位素 35S标记的GP120-1或者放射性同位素 35S标记的GP120-2、10yg的皿K-CCR5细胞膜 蛋白（准备操作均在冰上完成），然后在常溫约20°C下解育90分钟，之后离屯、两次（13000g、 5min，4°C)，然后加入1ml测量放射性同位素计数用的闪烁液(购自化rkineImer)，混匀，使 用化rkinelmer的0/丫计数器获取放射性同位素的读数可换算出放射性同位素 35S标记的蛋 白与CCR5分子结合量，从而获得蛋白与CCR5分子的稳定结合饱和能力，结果如图6所示。
[0096] 由图6可知（W蛋白浓度作为横坐标、W蛋白与CCR5分子的结合力作为纵坐标;a代 表本实施例中WBHK-21细胞系表达纯化出的 35S标记的GP120-l，b代表本实施例中WBHK-21 细胞系表达纯化出的35S标记的GP120-2，c代表WSF2细胞系表达纯化出的 35S标记的GP120-1，d代表WSF2细胞系表达纯化出的35S标记的GP120-2;a和b为实验组，C和d为对照组），实验 组和对照组的GP120-1和GP120-2均可W稳定结合皿K-CCR5细胞膜表面的CCR5分子，此外， 实验组的GP120-1和GP120-2的最大分子识别量(分别是0.9732pmol/mg和0.9501pmol/mg) 均大于对照组的6?120-1和6?120-2的最大分子识别量（分别是0.40 299111〇1/111邑和 0.5200pmol/mg)。由此表明，WBHK-21细胞系表达纯化出的的35S标记的GP120-1和 35S标记 的GP120-2的识别能力要强于WSF2细胞系表达纯化出的35S标记的GP120-1和 35S标记的 GP120-2,进一步说明了B皿-21细胞的翻译系统和修饰系统对蛋白的生理活性具有很大支 持作用。
[0097] 另外，在其他的实施例中，采用本发明生物活性蛋白在真核细胞中的表达方法还 可W表达其他类型的艾滋病病毒膜蛋白例如R5型或X4型，或者其他类型的需要经过翻译和 修饰后才有生物活性的蛋白，只需要将编码该类型蛋白的相应的外源基因按本发明实施例 提供的表达纯化方法克隆至本发明的PSFV2载体上，然后按本实施例提供的相应操作步骤 进行，即可表达出高纯度的、具有生物活性的蛋白。
[009引实施例2
[0099] 本实施例W表达纯化可溶性CD4蛋白为例来说明本发明的特征和性能。
[0100] 本实施例表达纯化CD4蛋白的原理和步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，在 制备病毒载体步骤中，用本实施例的CD4基因替换实施例1的GP120-1基因即可。CD4基因编 码CD4蛋白，CD4基因的核巧酸序列如SEQ ID NO.6所示，所示核巧酸序列为CD4蛋白的编码 序列。
[0101] 本实施例得到的CD4蛋白的蛋白凝胶电泳结果如7所示。
[0102] 从图7可知(M为蛋白marker，1为CD4蛋白标准品（可从NIH AIDS Reagent program (美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目）获得）、2为本实施例表达纯化得到的CD4蛋白），本 实施例得到的CD4蛋白的分子量为54Kda，与CD4标准蛋白的具有一致的蛋白条带，相对于现 有的表达纯化方法得到的目的蛋白的分子量缩小或增加的现象，图7的结果表明采用本实 施例提供的表达纯化方法得到的CD4蛋白具有正常的分子量。
[0103] 本实施例提供的CD4蛋白的生物活性实验如下。
[0104] CD4蛋白抑制艾滋病病毒感染宿主细胞的能力艾滋病病毒感染寄主细胞的途径首 先需要艾滋病病毒膜蛋白GP120跟寄主细胞膜表面的CD4分子结合，然后再结合其辅助受体 CCR5或者CXCR4。本实验W本实施例得到的CD4蛋白作为括抗剂，检测不同浓度的CD4蛋白去 抑制艾滋病病毒X4亚型的膜蛋白（GP120-X4)与寄主细胞(本实验为人体外周血纯化得到的 单核细胞化uman PBMC))细胞膜的CD4分子相结合的能力，进而反映出CD4蛋白在抗艾滋病 毒感染寄主细胞方面的生物活性。具体的实验过程如下，在50iil DMBl培养基(含有10%小 牛血清、1 %的IOOX penicillin/streptomycin)里加入SOul的带有巧光素酶（Luciferase) 标记的艾滋病病毒颗粒(含有20ng的P24衣壳蛋白浓度的病毒颗粒）、PBMC细胞液(含200000 个PBMC细胞、该PBMC细胞经Ing/ml PHA(植物血凝素)和Ing/ml的比-2白介素刺激72小时后 得到的）、加入50iil CD4蛋白液(含不同浓度的CD4蛋白），在37°C培养箱培育48小时完成细 胞感染反应。48小时后通过连续离屯、方式，然后使用Promega的ReniIla Luciferase Assay System化2820)提供的试剂对细胞进行裂解，然后使用Mithras LB 940Multimode Microplate Reader(巧光和光谱计数机)对细胞裂解液所含的病毒感染量进行量化分析 (检测其Renila Luciferase化it信号），再通过药理模型推算CD4蛋白抑制艾滋病感染病 毒的能力（I巧0,抑制半浓度），结果如图8所示。
[0105] 由图8可知（图中a代表本实施例WBHK-21细胞系表达纯化出的CD4蛋白、b代表W SF2细胞系表达纯化出的CD4蛋白，a为实验组，b为对照组），随着CD4蛋白浓度的增加，实验 组和对照组的抗艾滋病毒入侵能力也增加，此外，实验组的抗滋病毒入侵能力强于对照组。 也进一步说明，采用本实施例提供的生物活性蛋白在真核细胞中的表达方法所得到的目的 蛋白具有较强生物活性、生理活性W及药理活性，还说明，W哺乳动物细胞BHK-21细胞系作 为宿主细胞表达纯化的目的蛋白的生物活性、生理活性W及药理活性高于W昆虫细胞SF2 细胞系作为宿主细胞表达纯化的目的蛋白。
[0106] 综上所述，本发明提供的生物活性蛋白在真核细胞中的表达方法，所得到的目的 蛋白均经过了真核细胞尤其是幼仓鼠肾细胞的蛋白翻译和修饰系统的翻译修饰，具有较强 的正常分子量、生物活性、生理活性W及药理活性;且通过在目的蛋白的末端融合具有高亲 和力的特异性标签多肤，提高目的蛋白的纯化度，便于其后期的分离纯化，使得实际纯化分 离出的目的蛋白与理论上的目的蛋白的相似性接近100%，纯度非常高；因此采用该表达方 法得到的目的蛋白可W通过代谢标记法标记巧光标签或者放射性同位素标签作各类生物、 医学、药学临床和基础研究，如药物筛选、中和性抗体筛选、分子标记定位、蛋白标准品制 备;采用该表达方法表达蛋白还具有生产周期短，成本低等特点。
[0107] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，其包括： 将外源基因连接至载体质粒，再将所述载体质粒和包装质粒转染包装细胞，培养转染 后的所述包装细胞，得到病毒载体，所述载体质粒为PSFV2，所述包装质粒为pHelper; 将所述病毒载体转染宿主细胞，经培养后，收集上清液，所述宿主细胞为真核细胞；以 及 离心、纯化所述上清液，得到所述外源基因表达的具有生物活性的目的蛋白。2. 根据权利要求1所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述真核细胞为哺乳动物细胞。3. 根据权利要求2所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。4. 根据权利要求1所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述外源基因的终止子后还连接有特异性标签，所述特异性标签用于编码至少一个特异性标 签多肽。5. 根据权利要求4所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述特异性标签多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。6. 根据权利要求5所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述特异性标签多肽为两个。7. 根据权利要求6所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述特异性标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。8. 根据权利要求1所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，制 备所述病毒载体的步骤还包括:用限制性内切酶对所述载体质粒和所述包装质粒进行酶切 处理，形成线性DNA，再将所述线性DNA经转录得到RNA，将所述RNA转染所述包装细胞。9. 根据权利要求8所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所 述限制性内切酶为Spel。10. 根据权利要求1所述的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于， 还包括:将得到的所述目的蛋白在凝胶上进行垂直电泳，将电泳后的所述凝胶置于考马斯 亮蓝染色液中浸泡14~16小时，进行显色。
【文档编号】C12N15/86GK105861557SQ201610402759
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】柴梦莹
【申请人】柴梦莹