专利名称：一种单个微生物细胞进行观察的方法
技术领域：
本发明属于微生物观察领域，具体地说，本发明涉及一种对单个微生物细胞进行观察的方法。
背景技术：
在微生物学领域，对于单个微生物细胞的实验已经在多项研究中进行了，比如亚细胞结构的定位和微生物细胞行为学研究等。在这些研究中，细胞捕获扮演了不可缺少的角色。
早期的微生物学家曾使用一种名为悬滴法的方法对微生物细胞进行观察。在研就过程中，一块有圆形凹槽的玻片被使用。观察前，向凹槽中滴加一滴溶液，然后沾取少量微生物细胞置于溶液中，最后用盖玻片盖住凹槽并密封。之后就可以在显微镜下观察了。该方法限制了微生物细胞的活动范围，从而使细胞的活动能够较长时间的被观察。但是，由于在实验过程中，微生物细胞处于自由运动状态，所以无法对细胞内部的物质运动和亚细胞定位进行研究。密封的实验体系也给更换细胞生存环境带来了困难。2003年，Xiao-Hong Nancy Xu搭建了一个微型管道来限制微生物细胞的活动，从而对微生物细胞的生理活动进行研究(Xiao-Hong Nancy Xu et al.2003 Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.305，pp79-86.)。实验效果在悬滴法的基础上得到了很大的提高，但是悬滴法的缺陷却没有被完全克服。
Joe Pogliano为了能研究单个细菌的膜动力学(Joe Pogliano et al，1999，MolMicrobiol.Vol.31，p1149-1159)，使用了被L-赖氨酸处理过的玻片，然后把被研究的微生物细胞黏附在该玻片上，从而做到了对单个微生物细胞的定点观察和研究。随后，Philippe Cluzel也发展出了一种细胞捕获和固定的方法(PhilippeCluzel et al，2000，Science.Vol.287，p1652-1654.)，并用于单个微生物细胞的研究。在Philippe的方法中，玻片被硅烷化后，与鞭毛抗体相连。鞭毛抗体又可以与菌体的鞭毛发生抗原-抗体作用。最终导致细胞被固定在玻片表面。这些技术加速了在单个微生物水平的研究。同时，他们也具有一定的局限性无法长时间的进行实时观测，细胞周围环境无法在人为控制的情况下进行更换等等。
为了研究细胞内单分子运动情况，Deich J使用了琼脂糖凝胶固定分子并进行观测。在Deich J的实验中，细胞质液被包埋入了琼脂糖凝胶中，凝胶被夹在两块玻片之间，然后进行定点研究。该方法并没有固定细胞。且使用这种方法，研究只能连续进行2个小时。被固定的溶液成分也无法改变。
琼脂糖作为一种普遍的材料曾经被用于固定微生物细胞，形成人工生物膜(Biofilm)。在F.Perrot(F.Perrot et al，1998，Wat.Res.Vol.32，pp.3521-3526)和J.I.S.Khattar(J.I.S.Khattar et al，1999，Enzyme and Microbial Technology.25，564-568).的实验中，高浓度的琼脂糖凝胶限制了微生物细胞的活动，且上述实验是以微生物细胞群体作为研究的对象的。无法满足对单个微生物细胞进行研究的需要。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种单个微生物细胞进行观察的方法，通过该方法可以在较长时间内，即时地、定点地对细胞进行观察，还可以更换细胞周围溶液的成分，从而提高了单个微生物细胞试验的可操作性。
为了实现上述目的，本发明对单个微生物细胞进行固定观察的方法，其步骤是步骤1.制备琼脂糖凝胶。在本发明中，所使用的琼脂糖凝胶的浓度处于0.2克/100毫升～2克/100毫升之间。凝胶制备时，先称取0.02～0.2克的琼脂糖粉，然后按浓度要求溶解于10毫升的双蒸水中，并直接经过115℃30分钟或121℃20分钟灭菌得到。琼脂糖凝胶最终冷却至38～42℃，保温待用。
在本发明的一个具体实例中，制备琼脂糖凝胶组分为琼脂糖 0.1克蒸馏水 10毫升经过115℃30分钟灭菌，后静置冷却，至38～42℃时保温待用。
步骤2.微生物细胞悬液的制备。微生物细胞悬液是含有微生物细胞的培养液(根据微生物细胞的不同可使用不同的培养基，如YPD培养液或者LB培养液)。本发明中具体准备过程包括首先接种单菌落至培养基(YPD或LB)中，活化即将被研究的微生物细胞至稳定期。然后根据试验具体要求转接细胞至新鲜的培养基(YPD或LB)中继续培养。当细胞生长至试验要求的对数期或稳定期时取出含有细胞的培养液待用。在本发明的具体实例中，挑取酿酒酵母单菌落至5毫升YPD液体培养基中，在28℃震荡过夜进行活化。然后吸取0.05毫升含有酵母的YPD溶液，转接至5毫升新鲜的YPD液体培养基中，28℃震荡4小时。其中，YPD成分如下酵母提取物 1克/100毫升蛋白胨 2克/100毫升葡萄糖 2克/100毫升另外，LB培养液成分如下酵母提取物 0.5克/100毫升蛋白胨 1克/100毫升氯化钠 1克/100毫升步骤3.微生物细胞悬液和琼脂糖凝胶混合液的制备。琼脂糖凝胶和微生物细胞悬液分别按照步骤1和2进行准备。之后琼脂糖凝胶和微生物细胞悬液可按不同的体积比进行混合，体积比范围为10比1到1比10，最常使用的体积比是1比1。具体操作是吸取细胞悬液放置于三角烧瓶中，然后向其中加入等体积的琼脂糖凝胶。震摇烧瓶达到混合目的。于是得到一种混合液。
步骤4.将混合液倒于载物片上将玻璃条粘附在另一块载玻片上，在工形凹槽中央刻出蚀刻线，将混合液倒于载物片上，继续冷却至25～30℃。在本发明中，载物片拥有一个“工”形凹槽(图4B)。其加工方法是在一块普通载玻片材料切出2块1.0厘米×2.5厘米的玻璃条和2块.07厘米×3.0厘米的玻璃条。然后将4块玻璃条按图4B所示粘附在另一块载玻片上。并在“工”形凹槽中央刻出蚀刻线，用于划分区域。将步骤3制备得到混合液用移液器吸取2～3毫升混合液点加在载物片的“工”形槽上，然后压上盖玻片，混合液将逐渐填满“工”形槽。之后静置于超净工作台内，冷却至25～30℃。
步骤5.将上述混合液和载物片一齐固定于显微镜上，进行操作和观察。在上述混合液冷却至25～30℃后，就可以将载物片移至显微镜的载物台上，并用透明胶固定。
步骤6.观察及更换细胞周围溶液。使用显微镜、照相机和电脑组成的系统(如图4A)便可对固定微生物细胞进行单个的观察和拍照。细胞周围溶液的更换是利用滤纸吸水作用作为动力来完成的。更换溶液时，在载物片“工”形槽的一边用滤纸吸取原有溶液，而在另一边逐渐补充替换溶液(用于取代原溶液)，每次进行5～10分钟即可，多次更换可以增强效果。在具体实例中，原溶液是YPD，替换溶液是事先制备好的双氧水溶液(浓度为3微摩尔/升)，利用上述操作进行细胞周溶液的更换，每次5分钟，一共3次即可。
在本发明中，对被研究菌体的选择十分重要。由于群体培养的细胞经常处于不同的细胞周期，所以在研究过程中常常出现细胞的行为不同的现象。这要求研究者依照试验要求确定被观察微生物细胞的培养时间，并在研究时应同时观察多个单细胞，以提高试验的可重复性。同时应注意试验过程中保持试验温度和湿度的稳定性。
采用本发明提供的方法与现在所使用的方法相比，本发明的方法简便、操作性强、试验时间长、实验结果可以重复等特点。与悬滴法和微管道法相比，本发明提供的方法可以随意控制微生物细胞的活动范围和程度，这使得研究细胞内物体运动成为可能。本发明比Pogliano的方法更加简便，且具有可更换细胞周围溶液成分和不干扰细胞正常生理活动的特点。Deich J也使用琼脂糖凝胶固定技术，但是其试验时间被限制在2小时之内，在其试验中溶液成分也不可更换。在Deich J的基础上，新发明的载物片促使对单个微生物细胞的研究能连续进行4.5小时以上，且在试验过程中可以人为地改变被观察细胞周围的溶液成分。同时使用了较低浓度的琼脂糖凝胶(0.2～0.4克/100毫升)对微生物细胞进行固定，从而降低了固定剂对细胞生理活动的限制。另外，与微流体法相比，本发明成本低廉。
在本发明中使用的各种单位，有国家标准的一律采用国家标准，无国家标准的采用行业标准。
图1为双氧水诱导酵母细胞凋亡的动态观察的图片。
利用本发明所提供的方法和装置，对双氧水诱导酵母细胞凋亡的动态过程进行观察。A1、B1、C1、D1是在明视场下拍摄的图片。A2、B2、C2、D2是在荧光场下拍摄的图片。A1和A2是在酵母细胞被观察70分钟时的图象，此时细胞周围没有双氧水。图A1显示细胞成椭圆形且饱满。在荧光场下细胞被联眯基苯吲哚(DAPI)染色，图A2显示核聚集而清晰。拍摄图A1和A2后双氧水被引入细胞周围；B1和B2是细胞接触双氧水60分钟时的影象；C1和C2是细胞接触双氧水130分钟时的影象。D1和D2是细胞接触双氧水210分钟时的影象。图B、C、D显示了酵母细胞在接触双氧水后的动态变化情况细胞出现皱缩，核逐渐扩散且模糊。本图说明本发明允许更换细胞周围溶液成分，并做记录动态过程。
图2为记录假单胞菌的分裂过程的图片。
使用同样的方法和装置进行观察假单胞菌的分裂过程。每分钟拍摄一张照片进行记录，连续进行40分钟。选取4张图片A、B、C、D进行展示。结果显示假单胞菌在该浓度的琼脂糖凝胶中成功的完成了分裂过程。这说明在本发明的体系中，细胞正常的生理活动没有被干扰。
图3为记录细胞内物体活动情况的图片。
在本试验中，细胞同样被联眯基苯吲哚(DAPI)染色。选取不同视野的两个细胞作为研究对象。显微镜以0.05秒一张的速度分别进行拍摄，连续拍摄100张。各选取4张作为结果展示(图3)。结果显示胞内有物体快速活动，并被清楚地记录。显示了本发明提供地系统和方法可以用于胞内物体活动、亚细胞定位等研究。
图4为细胞操作及研究装置和载物片示意图。
A显示整个实验装置，包括载物片、盖玻片、细胞、显微镜、照相机、光学系统及电脑分析系统等。B显示了本发明中所使用的载物片及盖玻片。
具体实施例方式
实施例1下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
1.1琼脂糖凝胶的制备称0.1克琼脂糖粉，分别溶解于10毫升的蒸馏水中，115℃灭菌30分钟。之后冷却至40℃存放待用。
1.2 YPD液体培养基配制及细胞悬液的制备称10克酵母提取物，20克蛋白胨，溶解于900毫升蒸馏水中，同时称20克葡萄糖溶解于100毫升蒸馏水中。上述溶液115℃灭菌30分钟。然后混合形成YPD液体培养基。每5毫升分装一只试管待用。挑取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，CCTCC AY97003)细胞单菌落，至于5毫升YPD液体培养基中28℃震摇至稳定期。然后，吸取0.05毫升菌液至于5毫升新鲜的YPD液体培养基中，28℃震荡4小时。
1.3细胞悬液和琼脂糖凝胶混合液的制备吸取上述的细胞悬液1克/100毫升制备好待用的琼脂糖凝胶按1比1的体积比混合。
1.4混合液倒于载物片上，压片后冷却至28℃。
1.5将载物片移至显微镜载物台上固定。
1.6观察并更换固定细胞周围溶液，诱导酵母细胞凋亡使用倒置荧光显微镜(FM，Olympus IX-70)和油镜(Olympus，100×，N.A.＝1.35)观察被研究的酵母细胞，同时使用ICCD照相机进行拍摄。细胞用DAPI染料对其染色体进行着色。然后连续观测70分钟后，更换细胞周围溶液成分，使双氧水(浓度为3毫摩尔/毫升)进入细胞周围。继续连续观测并记录细胞情况。选取第70分钟、130分钟、200分钟和280分钟的图象作为试验结果进行展示(图1)。结果表明，在加入双氧水后，酵母细胞开始缩小，且其染色体开始逐渐地分散。这暗示了本发明提供的体系可以进行细胞周围溶液成分的更换，并可以连续观测4.5小时左右。
实施例22.1琼脂糖凝胶的制备称0.05克琼脂糖粉，分别溶解于10毫升的蒸馏水中，115℃灭菌30分钟。之后冷却至40℃存放待用。
2.2 LB液体培养基配制及细胞悬液的制备称5克酵母提取物、10克蛋白胨、10克氯化钠，溶解于1000毫升蒸馏水中，每5毫升分装一只试管，115℃30分钟灭菌后待用。同样挑取假单胞菌(Pseudominas aeruginosa，CCTCC AB91095)的单菌落，至于5毫升LB液体培养基中，30℃震摇过夜，然后，吸取0.05毫升菌液至于5毫升新鲜的LB液体培养基中，30℃震荡2小时。
2.3细胞悬液和琼脂糖凝胶混合液的制备按1比1的体积比，吸取菌液与0.5克/100毫升制备好待用的琼脂糖凝胶进行混合。形成混合液。
2.4混合液倒于载物片上，压片后冷却至30℃。
2.5将载物片移至显微镜载物台上固定。
2.6观察假单胞菌的分裂的情况使用同样的系统进行观察。并且，每分钟拍摄一张照片进行记录。结果(图2)显示假单胞菌在该浓度的琼脂糖凝胶中成功的完成了分裂过程。这说明在本发明的体系中，细胞正常的生理活动没有被干扰。
实施例33.1琼脂糖凝胶的制备称0.1克琼脂糖粉，分别溶解于10毫升的蒸馏水中，115℃灭菌30分钟。之后冷却至40℃存放待用。
3.2YPD液体培养基配制及细胞悬液的制备称10克酵母提取物，20克蛋白胨，溶解于900毫升蒸馏水中，同时称20克葡萄糖溶解于100毫升蒸馏水中。上述溶液115℃灭菌30分钟。然后混合形成YPD液体培养基。每5毫升分装一只试管待用。挑取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，CCTCC AY97003)细胞单菌落，至于5毫升YPD液体培养基中28℃震摇过夜。然后，吸取0.05毫升菌液至于5毫升新鲜的YPD液体培养基中，28℃震荡4小时。
3.3细胞悬液和琼脂糖凝胶混合液的制备吸取菌液与1克/100毫升制备好待用的琼脂糖凝胶按1比1的体积比混合。
3.4混合液倒于载物片上，压片后冷却至28℃。
3.5将载物片移至显微镜载物台上固定。
3.6胞内活动的记录该试验中，细胞同样被DAPI染色。选取不同视野的两个细胞作为研究对象。显微镜以0.05秒一张的速度分别进行拍摄，连续拍摄100张。各选取4张作为结果展示(图3)。结果显示胞内有物体快速活动，并被清楚地记录。显示了本发明提供地系统和方法可以用于胞内物体活动、亚细胞定位等研究。
权利要求
1.一种单个微生物细胞进行观察的方法，它包括下列步骤A、制备琼脂糖凝胶先称取0.02～0.2克的琼脂糖粉，然后溶解于10毫升的双蒸水中，经过115℃30分钟或121℃20分钟灭菌，琼脂糖凝胶冷却至38～42℃，保温待用；B、微生物细胞悬液的制备首先接种单菌落至培养基中，活化微生物细胞至稳定期，然后转接细胞至培养基中继续培养，当细胞生长至对数期或稳定期时取出含有细胞的培养液待用；C、微生物细胞悬液和琼脂糖凝胶混合液的制备琼脂糖凝胶和微生物细胞悬液分别按照步骤A和B进行，琼脂糖凝胶和微生物细胞悬液按体积比进行混合，体积比范围为10比1到1比10，吸取细胞悬液放置于三角烧瓶中，然后向其中加入等体积的琼脂糖凝胶，震摇，得到一种混合液；D、将混合液倒于载物片上将玻璃条粘附在另一块载玻片上，在工形凹槽中央刻出蚀刻线，然后将步骤C制备得到的混合液用移液器吸取2～3毫升点加在载物片的工形槽上，然后压上盖玻片，混合液将填满工形槽，之后静置于超净工作台内，冷却至25～30℃；E、将上述混合液和载物片固定于显微镜上，进行操作和观察在上述混合液冷却至25～30℃后，将载物片移至显微镜的载物台上，并用透明胶固定；F、观察及更换细胞溶液使用显微镜、照相机和电脑组成的系统对固定微生物细胞进行单个的观察和拍照，在载物片工形槽的一边用滤纸吸取原溶液，在另一边补充替换溶液。
全文摘要
本发明公开了一种单个微生物细胞进行观察的方法，其步骤是A.制备琼脂糖凝胶；B.微生物细胞悬液的制备；C.微生物细胞悬液和琼脂糖凝胶混合液的制备；D.将混合液倒于载物片上，用移液器吸取混合液点加在载物片的工形槽上至填满工形槽，压上盖玻片，静置、冷却；E.将上述混合液及载物片一齐固定于显微镜上，并用透明胶固定；F.观察及更换细胞溶液。本发明方法简便，操作性强，可在较长时间内，即时地、定点地对细胞进行观察，还可以更换细胞溶液，从而提高了单个微生物细胞试验的操作性。
文档编号C12N1/00GK1654625SQ200510018150
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者刘茴茴, 杨怡然, 谢志雄, 沈萍 申请人:武汉大学