污染的微生物全细胞发光报告传感器及其制备的试剂盒和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种监测Hg2+污染的微生物全细胞发光报告传感器及其制备的试剂盒和应用。所述的用于监测环境中Hg2+污染的全细胞发光传感器是以高耐汞细菌为宿主，在其中导入含merR-Pt的抗汞基因调控区和egfp基因而构建的全细胞发光传感器工程菌。试剂盒中包含该菌的固定化细胞培养物，以及适合于测定的专用缓冲液。该传感器试剂盒可专一且高灵敏监测土壤、河流、湖泊、地下水、市政污水处理系统中毒性最强的重金属Hg2+污染。与已有技术相比，本发明的微生物全细胞传感器专一性和适应性强，使用方便，监测灵敏度高，可实现高通量在线监测。
CCTCC NO：M 2014351
2014.07.21
【专利说明】监测Hg2+污染的微生物全细胞发光报告传感器及其制备的 试剂盒和应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种含抗汞基因启动子和报告基因的微生物全细胞发光报告传感 器试剂盒、及生产、使用的方法和用途。
【背景技术】
[0002] 汞是一种具有严重生理毒性的化学物质。由于其具有持久性、易迁移性和高度的 生物富集性，使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。据最新资料统计，目前水、 土壤、大气中汞的含量较多年前已经提高了 3倍，众所周知，汞污染对人类具有极大的危 害。人体无法通过自身的代谢排泄食物链或其它途径累积的微量汞，微量汞累积将直接导 致心脏、肝、甲状腺等疾病，甚至导致神经系统紊乱及慢性汞中毒。在工业化工程中，国际上 相关地区曾出现过严重的大面积汞中毒事件，并严重影响了当地人民的生命。为此，国际社 会对汞的关注程度极高，并提出了极为严格的控制要求，例如，2003年2月欧盟提出的针对 中国高达270亿美元的要求新电子和电气设备中确保无汞（Hg)等有害物质，从而要求国内 相关企业必须找出应对措施、改进检测方法、提高检测标准，同时质量检测部门必须要提高 其对汞元素的监控能力和手段。
[0003] 环境中重金属介质的毒性依赖于环境中生物可利用的金属离子的浓度。发光型 微生物传感器已被广泛应用于研究检测生物可利用的金属离子。Ralstonia eutropha AE2515已被构建出来，通过将cnrYXH调节基因转录融合到生物发光luxCDABE报告系统来 构造出一个完整的细胞传感器用于检测土壤中生物可利用的Ni 2+和Co2+的浓度（Tibazarwa et al. 2001)。还有一些光学传感器的工程细菌中包含mer基因的调控区域（merR)和 luxCDABE的融合片断，这已被发展用于对Hg2+的定量测定。当Hg2+结合到merR上时， mer启动子即表示出活性，接着引起Iux报告基因的转录，随后发出亮光（Selifonova et al. 1993)。土壤中生物可利用的铜离子也可通过荧光假单胞工程菌测出，方法是通过铜离 子诱导的基因和含有Tn5: : Iux启动子转座子探针来实现（Tom-Petersen et al. 2004)
[0004] GFP是从多管水母属的Aequorea Victoria中分离出的一种天然突光蛋白，含有 238个氨基酸残基。Aequoria的GFP在395nm能吸收蓝光，受到Ca 2+或紫外线激活时发绿 色突光，最大发射峰为509nm。GFP的生色团为一个稳定的环状三肽结构，由Ser65、Tyr66 和Gly67这3个氨基酸残基通过自身环化和氧化形成，生色团之间是通过共价键结合。野 生型GFP的荧光强度较低，细胞质中约I X IO4个GFP分子发射的荧光才能用普通荧光显微 镜精确测定。通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同激发峰和发射 峰的突变体，使GFP荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。
[0005] 由于GFP基因表达产物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记检测十分 方便简单，被广泛用于科学研究工作中。GFP作为环境微生物的标记基因的优点：（1)荧光 特性稳定。只有过热（>65°C )、过酸（pH〈4)、过碱（pH为12?13)或其他变性剂存在时GFP 的荧光才会消失。（2)检测极为方便。对GFP的检测仅需蓝光和近紫外光激发，不需要 任何外源基质，也不必对细胞进行预处理、固定或染色；用普通荧光显微镜或手提式紫外灯 (365nm)照射即可进行观察，使用激光扫描共聚焦显微镜效果更佳，还可以使用细胞分选仪 检测。能在现场进行在线检测。（3)GFP的表达与受体细胞的种属无关，原核和真核细胞都 能表达，而且对细胞没有毒性，不会扰乱受体细胞的正常功能。（4)能进行单细胞和活细胞 观察，也可进行实时原位观测，不会破坏被观察的细胞及其生长环境。（5) 土著微生物中不 含有GFP，因而检测GFP时一般不会出现假阳性结果。
[0006] 通常将GFP作为分子标记。研究表明，可将GFP基因加以改造，去除其多余、调控 片断，人为添加调控元件，构建应用于环境监测的报告基因表达系统。另外，GFP基因可用 许多载体、以不同方式导入到原核生物细胞内构建报告基因表达系统。如可将GFP基因与 质粒构成重组体后导入，还可通过嗜菌体以转导方式转移到宿主细胞中。转移GFP基因的 载体除常用的质粒外，还有很多转座子载体，如Min-MiuTn系列等。
[0007] 目前国内尚未见到有关构建稳定重组merR-Pt启动子和报告基因及它的用途方 面的专利和报道。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种监测Hg2+污染的微生物全细胞发光报告传感器，及基于同一发 明构思下的重组载体、宿主菌，以及包括该微生物全细胞发光报告传感器的试剂盒，有效地 解决了现有技术存在的问题。
[0009] 本发明公开了一种用于监测环境中Hg2+污染的大肠杆菌与假单胞菌穿梭重组质 粒pUCpl8-MP，是以pUCpl8为骨架，在EcoRI、XhoI及XhoI、BamHI位点分别插入egfp片段、 merR-Pt启动子片段而获得。
[0010] 本发明公开了一种用于监测环境中Hg2+污染的高耐汞细菌BMB-Hg，是恶臭假单胞 菌（Pseudomonas Putida)，它的保藏号是 CCTCC NO :M 2014351。
[0011] 本发明公开了一种用于监测环境中Hg2+污染的工程菌BMB-MP，即微生物全细胞 发光报告传感器；它是以所述的恶臭假单胞菌BMB-Hg为宿主菌，在宿主菌中含有重组质粒 pUCpl8-MP。
[0012] 本发明还公开了所述的工程菌BMB-MP在监测环境中Hg2+污染中的用途。
[0013] 本发明提供了一种用于监测环境中Hg2+污染的试剂盒，其组成为：包埋固定化的 如权利要求3所述的BMB-MP菌株颗粒、检测缓冲液和全黑带盖96孔板；所述缓冲液的配 方是：1000mL去离子水中，NaH 2PO3O. 3g，Na2HP032. 2g，NaCl 8. 5g，微量元素液lmL，葡萄糖 0. lg，NaNO3O. lg，60% H2O2O. lmL，缓冲液pH值为7. 2 ;其中微量元素液配比如下：五水硫 酸铜：0. 816g、碘化钾：0. llg、钥酸铵：0. 272g、氯化锌：0. 272g、硫酸亚铁：0. 884g、氯化钴： 0. 68g、去离子水：1. 36L。所述缓冲液是在基础缓冲液的基础上，设计正交试验，复合添加微 量C源、N源、0(分别为葡萄糖0. lg、硝酸钠 0. lg、过氧化氢0. ImL)。该缓冲液可作为样品 稀释液及固定化菌体颗粒保护剂增加菌体在保藏和测定时的活力。
[0014] 一种所述的试剂盒检测Hg2+污染的方法，是通过在缓冲液体系中加入固定化的 BMB-MP菌株颗粒，经Hg2+的诱导引起菌体细胞荧光蛋白表达，以荧光强度的变化来检测环 境中Hg 2+的污染。
[0015] 具体步骤如下：取固定化BMB-MP颗粒8颗，分别加入两个黑色96孔板检测孔中， 每孔4颗，分设为对照孔和测定孔；在测定孔中加入缓冲液稀释好的待测样品100 μ L，对照 孔中加入空白缓冲液100 μ L ;震荡摇匀，然后盖上黑色板盖置于20°C孵育12小时；孵育完 毕后在多功能酶标仪检测槽中直接检测对照和测定孔的荧光强度，检测条件设置为：激发 波长480nm，发射波长507nm ;根据标准曲线即可算出样品中汞污染的浓度；计算公式如下： (Y测定一Y对照一〇· 0966)/0. 0066 = X ;其中Y为荧光强度，X为污染物浓度。
[0016] 本发明中所述的固定化菌株是采用对菌体无毒无害的2%海藻酸钙通过一定比例 混合BMB-MP菌株进行包埋，而制成直径2mm的固定化报告菌颗粒。将固定化的报告菌颗 粒与灭菌缓冲液以等体积1:1混合，置于冰箱4°C冷藏1-4周，该固定化报告菌活力维持在 90%以上，其有效期可达到1个月左右。所述BMB-MP菌株是一种全细胞发光传感器工程 菌，它是以筛选到的野生型高耐萊细菌恶臭假单胞菌（Pseudomonas Putida) BMB-Hg (保藏 号CCTCC NO :M 2014351)为宿主，在其中导入含merR-Pt的抗汞基因调控区和egfp基因 的重组载体。该重组载体包含特异识别汞离子的调节基因及其下游汞转运蛋白基因启动子 (merR-Pt)，并与报告基因 egfp重组表达。该报告基因的活性测定不需要裂解细胞，能活体 检测，且稳定性好操作过程相当方便。
[0017] 因本发明中采用的报告基因是egfp，其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类 型的限制，活性测定不需要裂解细胞，能进行活体检测，对细胞无毒害，无需底物或共反应 因子。使用该系统用来检测Hg 2+污染时具有检测方便，结果可靠，适用范围广，不对生态环 境造成二次污染的特点。
[0018] 本发明试剂盒中包含该菌的固定化细胞培养物，以及适合于测定的专用缓冲液。 该传感器试剂盒可专一且高灵敏监测土壤、河流、湖泊、地下水、市政污水处理系统中毒性 最强的重金属Hg 2+污染。与已有技术相比，本发明的微生物全细胞传感器专一性和适应性 强，使用方便，监测灵敏度高，可实现高通量在线监测。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图 lpUCpl8_MP 质粒图谱。
[0020] 图2BMB-MP菌体固定化颗粒。
[0021] 图3相对荧光强度与不同浓度Hg2+的关系曲线。
[0022] 图4固定化报告菌荧光强度随时间和Hg2+浓度变化曲线。
[0023] 图5固定化报告菌保藏时间及活性变化
[0024] 本发明中的恶臭假单胞菌BMB-Hg于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保 藏中心（地址：中国武汉大学），分类命名为恶臭假单胞菌BMB-Hg(Pseudomonas putida BMB-Hg)，保藏编号为 CCTCC NO :M 2014351。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图，对本发明作进一步描述。
[0026] 本发明的具体步骤为：构建含merR-Pt启动子和egfp报告基因的重组系统；将该 系统通过质粒转化到高耐汞的细菌细胞中。将该菌在一定条件缓冲体系中包埋固定，经Hg 2+ 的诱导使得绿色荧光蛋白表达，根据荧光强度的变化来检测环境中Hg2+污染。
[0027] 一、实验材料
[0028] 1、在本发明中涉及的菌种和质粒来源如表1。
[0029] 表1.菌种和质粒
[0030]
【权利要求】
1. 一种用于监测环境中Hg2+污染的大肠杆菌与假单胞菌穿梭重组质粒pUCpl8-MP，其 特征在于：是以pUCpl8为骨架，在EcoRI、XhoI及Xhol、BamHI位点分别插入egfp片段、 merR-Pt启动子片段而获得。
2. -种用于监测环境中Hg2+污染的高耐萊细菌BMB-Hg,是恶臭假单胞菌（Pseudomonas Putida)，它的保藏号是 CCTCC NO :M 2014351。
3. -种用于监测环境中Hg2+污染的微生物全细胞发光报告传感器BMB-MP菌株，其特 征在于，是以权利要求2所述的恶臭假单胞菌BMB-Hg为宿主菌，在宿主菌中含有如权利要 求1所述的重组质粒pUCpl8-MP。
4. 权利要求3所述的BMB-MP菌株在监测环境中Hg2+污染中的用途。
5. -种用于监测环境中Hg2+污染的试剂盒，其特征在于，其组成为：包埋固定化的如权 利要求3所述的BMB-MP菌株颗粒、检测缓冲液和全黑带盖96孔板； 所述缓冲液的配方是=IOOOmL去离子水中，NaH2PO3O. 3g，Na2HP032. 2g，NaCl 8. 5g，微 量元素液lmL，葡萄糖0. lg，NaNO3O. lg，60% H2O2O. lmL，缓冲液pH值为7. 2 ;其中微量元素 液配比如下：五水硫酸铜：〇. 816g、碘化钾：0. llg、钥酸铵：0. 272g、氯化锌：0. 272g、硫酸亚 铁：0. 884g、氯化钴：0. 68g、去离子水：1. 36L。
6. -种用权利要求5所述的试剂盒检测Hg2+污染的方法，其特征在于：是通过在缓冲 液体系中加入固定化的BMB-MP菌株颗粒，经Hg 2+的诱导引起菌体细胞荧光蛋白表达，以荧 光强度的变化来检测环境中Hg2+的污染。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤如下：取固定化BMB-MP颗粒8颗，分 别加入两个黑色96孔板检测孔中，每孔4颗，分设为对照孔和测定孔；在测定孔中加入缓冲 液稀释好的待测样品100 U L，对照孔中加入空白缓冲液100 y L ;震荡摇匀，然后盖上黑色 板盖置于20°C孵育12小时；孵育完毕后在多功能酶标仪检测槽中直接检测对照和测定孔 的荧光强度，检测条件设置为：激发波长480nm，发射波长507nm ;根据标准曲线即可算出样 品中汞污染的浓度；计算公式如下：(Ylte -Ywm - 0. 0966)/0. 0066 = X ;其中Y为荧光强 度，X为污染物浓度。
【文档编号】G01N21/64GK104313046SQ201410547211
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】何伟, 戴传超 申请人:南京师范大学