一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方 法。
【背景技术】
[0002] 多聚磷酸盐（Polyphosphate，poly P)是一种线性多聚体，由几个至上千个磷酸 盐残基通过磷酸酐键聚合而成，广泛存在于细菌、真菌以及高等哺乳动物细胞中。研宄显 示poly P的生物学功能主要包括：（1)细胞能量储存的一种方式；（2)磷的储存库；（3)金 属离子的螯合剂；(4)碱性离子的缓冲剂；（5)抵御外界环境压力的调控子；(6)基因表达 调控的辅助因子之一。在微生物中，poly P还与以下生理过程直接相关：（1)细菌的运动 性；（2)生物被膜的形成；（3)细菌的群体效应（Quorum sensing) ; (4)严紧反应（Strigent response) ; (5)孢子的形成；(6)捕食能力；（7)细菌毒性。除涉及生命科学的方方面面， 能合成poly P的微生物也是环境科学中污水处理和生物修复的重要组成部分，弄清环境中 poly P的循环及其在微生物体内的代谢，对于生物强化除磷意义重大。这就需要对环境样 品（自然水体、污染水体以及活性污泥等）和微生物中的PolyP含量进行测定，但到目前为 止依然缺乏一种专门针对poly P的快速准确的直接定量方法，宄其原因有以下两点：一是 样品自身的非均一性和化学成份的复杂性；二是poly P链长的多样性。
[0003] 目前poly P主要的定量方法包括31P-核磁共振检测法（31P Nuclear Magnetic Resonance，31P_NMR)、化学分离和提纯法、外切聚磷酸酶（Exopolyphosphatase，ppx)水解 法、电子电离质谱分析法（Electron Ionization Mass Spectrometry，ESI_MS)和离子色谱 法（Ion Chromatography，IC)等。纵观目前的这些定量方法，还没有一种适合于常规实验 室使用的相对快速准确且重现性良好的poly P直接定量方法，这严重限制了对于poly P 的基础科学研宄。
[0004] 4'，6-二脒基 _2_ 苯基吲噪（4,，6-diamidino_2-phenylindole，DAPI)是由 Dann 等人于1971年合成的一种能够与富含A-T碱基对的双链DNA强力结合的荧光染料，它可以 透过完整的细胞膜，快速进入活细胞与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用。DAPI 的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm，而与双链DNA结合后，最大吸收波长变为 358nm，最大发射波长变为461nm，在此条件下DAPI-DNA复合物可以产生比DAPI自身强20 多倍的典型蓝色荧光，因此其多被用于细胞生物学和细胞遗传学的研宄。除用于DNA染色 外，早在1982年Tijssen JP等人发现DAPI同样可以与poly P结合形成DAPI-poly P复合 物，该复合物使用360nm激发后可在525nm处观察到典型的黄绿色荧光，因此早期被用于脆 壁酵母（Saccharomyces fragilis)等富含poly P微生物的染色观察。鉴于DAPI-DNA复 合物在360nm激发时也能发出高强度的荧光从而造成检测或观察DAPI-poly P复合物时荧 光背景值过高，一直以来，基于该原理的各种实验方法仅限于高浓度poly P (〇.5-10mM)的 检测和富含poly P微生物胞内poly P的定性观察，与上述的poly P定量方法相比也没有 显著的优势。直至2008年Aschar Sobbi等人从光谱分析方法的角度，优化了 DAPI-poly P 复合物的激发波长和检测波长，使得ng级的poly P可以被检测到。紧接着2010年DIAZ等 人在Aschar Sobbi的工作基础之上，以不同链长的poly P标准品为主要研宄对象，对检测 过程中的可能影响因素进行了全面的分析和讨论，完善了该方法。2013年Anna N. Kulakova 等人使用完善后的方法以及传统的先提取再分析的方法，对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)、醋酸妈不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus)以及活性污泥样品中poly P 的含量分别进行了测定比较，进一步确认了该方法的可行性和优越性。
[0005] 尽管在诸多定量方法中，DAPI染色法在微生物胞内poly P定量方面具有诸多显 见的优势，但到目前为止依然未被各国科研工作者广泛使用，国内也没有相关的报道。鉴于 学科间的差异，尽管从事光谱分析或化学分析的学者从自身的角度出发，对影响实验准确 性和重现性的各种因素（如标准品及样品的保存方式、样品的前处理方法、检测体系中各 种离子及其浓度的影响、检测时各种对照的设置等等）进行了详尽的分析，但对于非本专 业的普通科研工作者来说，当面对纷繁复杂的样品来具体应用该方法时，这似乎有些晦涩 难以理解，不知从何下手，因此开发一种基于该原理的简单高效的，适合普通生物学实验的 微生物胞内poly P的直接定量方法十分必要。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简单迅速，高效准确的适合普通生物学实 验的微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法，它包括如下步骤：
[0009] (1)样品的前处理与制备：
[0010] 将待测微生物接种于废水培养基中培养，取菌液测其OD6c?，测完后将菌液离心后 弃去上清液，用HEPES缓冲液重悬菌体，离心后弃去上清液，得到待检测样品；
[0011] ⑵微生物胞内多聚磷酸盐含量测定：
[0012] (2a)将待检测样品、HEPES缓冲液和DAPI染液混合后立刻涡旋混匀，孵育后再次 涡旋混匀，继续孵育，得到样品组混合液；
[0013] (2b)用超纯水代替DAPI染液，重复（2a)中的操作，得到样品对照组混合液；
[0014] (2c)将样品组混合液与样品对照组混合液分别按每孔200 μ 1的上样量上样至96 孔板；
[0015] (2d)将步骤（2c)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于415nm处激发，于550nm处 测定其荧光强度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于poly P标准曲线中读出 样品中poly P的含量Yp;
[0016] (3)囷体总蛋白测定：
[0017] (3a)将待检测样品上样至96孔板，加入DC Protein Reagents Package试剂盒中 所提供的Reagent A，轻轻混勾，15-25°C下孵育5min后加入试剂盒中所提供的Reagent B， 立刻吸吹混勾，显色15min后，得到样品组混合液；
[0018] (3b)用HEPES代替待检测样品，重复（3a)中的操作，得到样品对照组混合液；
[0019] (3c)将步骤（3a)和（3b)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于750nm处测定其吸 光度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于BSA标准曲线中读出样品中蛋白的 含量YA;
[0020] (4)微生物胞内多聚磷酸盐的定量
[0021] 获得Yp值和Y A值后，按以下公式将微生物胞内的多聚磷酸盐含量准确定量，最终 定量的单位为：yg(磷）/mg(菌体蛋白）；
[0022] 其中，微生物胞内多聚磷酸盐poly P含量Tpp= (ΥΡΧ3Χ30·9738Χ1〇-3)/ (YaX3X1〇UPT pp= 30.9738Yp/Ya。
[0023] 步骤（1)中，所述的废水培养基的配方为：葡萄糖0.3g、胰蛋白胨O.lg、酵母提 取物0. 〇lg、无水乙酸钠0. 15g、氯化钠0. 05g、七水合硫酸镁0. 262g、三水合磷酸氢二钾 I. 472g、氯化按0. 18g和去离子水1L，115°C下灭菌30min。
[0024] 步骤（I)、（2a)、（2b)和⑶中，所述的 HEPES 缓冲液为 20mmol/L、pH7. 0 的 HEPES 缓冲液。
[0025] 步骤（1)中，菌液与重悬菌体所用的HEPES缓冲液的体积比为I. 5 :0D6(J直；其中， 优选菌液体积为I. 5mL，HEPES缓冲液体积为0D